来源：Jagau, H. 等. 肺炎链球菌在恒定流体条件下感染原代人血管内皮细胞. J. Vis. Exp. (2019)
本视频展示了在持续培养基流动条件下，肺炎链球菌与内皮细胞上血管性血友病因子（VWF）串状结构实时结合的可视化过程。视频概述了刺激VWF释放、标记VWF串状结构以及定量分析细菌结合的各个步骤。
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方法文章
评估肺炎球菌在恒定培养基流动条件下对原代人内皮细胞的黏附作用
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2025年9月26日
本文内容
摘要
方案
1. 诱导血管性血友病因子（VWF）释放及多聚化VWF串状结构的可视化
- 保持流速设置，因为需要10 dyn/cm2的剪切应力以触发血管性血友病因子（VWF）形成长度可达200 MDa的多聚体长链。通过注射口将136 µL浓度为100 mM的组胺储备液注入正在灌注管路中循环的含补充混合物的内皮细胞生长培养基（ECGMS-培养基），以诱导内皮细胞Weibel-Palade小体（WPB）释放VWF。流体培养基中组胺的终浓度为1 mM。若无注射口，也可通过移液方式将组胺加入泵储液罐的培养基中。
- 为进行多聚化VWF长链的免疫荧光检测，当储液罐内培养基液面平衡时停止流动，通过注射口向循环的13.6 mL ECGMS-培养基中注入200 µL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中含有20 µg的VWF特异性异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗体。若无注射口，也可通过移液方式将抗体加入泵储液罐的培养基中。此时抗体终浓度为1.3 µg/mL。
- 为在短时间内对多个视野进行显微扫描，使用配备30%功率氙灯荧光装置和落射荧光相机的显微镜荧光单元。利用明场模式观察人脐静脉内皮细胞（HUVEC）层的形态与结构，选择具有代表性的细胞用于VWF长链的可视化观察。
- 为观察绿色荧光标记的VWF长链，选择显微镜软件（LasX）荧光单元菜单中的63倍/1.40数值孔径油镜物镜及470 nm检测滤光片。对至少50个代表性视野进行Z轴层扫成像，每个视野包含约10个形态完整的HUVEC细胞。为在不同时间点定量分析绿色荧光VWF长链，需扫描多个视野。
2. 实时流动条件下细菌黏附于VWF串的显微镜检测
- 通过免疫荧光检测定量肺炎链球菌在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表面形成的血管性血友病因子（VWF）串上的黏附情况。
- 暂停流动，通过注射口将最大体积为1 mL、浓度为1.35 × 108 CFU/mL、表达红色荧光蛋白（RFP）的肺炎链球菌加入ECGMS培养基中。或者，也可将细菌用移液器加入泵储液罐的培养基中。随后重新启动剪切应力至10 dyn/cm2，使细菌在泵系统中循环。
- 选择63倍油浸物镜进行显微镜放大，并在显微镜软件中调整荧光滤光片设置至RFP通道（540 nm检测滤光片），以检测表达RFP的肺炎链球菌。
- 为定量细菌在VWF串上的黏附情况，停止流动，对至少30个具有代表性的视野进行Z轴层扫成像，每个视野包含约10个形态完整的HUVEC细胞，并统计其中肺炎链球菌的数量。
- 采用单因素方差分析（ANOVA）算法对数据进行评估，随后进行事后双尾非配对样本检验以进行详细的统计比较。P值<0.05被认为具有统计学显著性。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 灌注管路夹 | Ibidi | 10821 | 用于在将载片连接至泵系统前，固定管路中的液体 |
| 计算机 | Dell | Latitude 3440 | 配备压力泵控制软件的计算机 |
| 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） | Leica | DMi8 | 倒置显微镜，配备可加热培养室载物台，以及带有荧光滤光片、氙灯光源（SP8, DMi8）和DFC 365 FX相机（1392 x 1040，1.4百万像素）的荧光单元 |
| 磷酸氢二钾（KH₂PO₄） | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | 用于PBS缓冲液的配制 |
| 干燥材料 | Merck | 101969 | 橙色硅胶珠，用于带管路接头的玻璃瓶中进行干燥 |
| 内皮细胞生长培养基补充剂混合液（ECGM supplement Mix） | Promocell | C-39215 | ECGM培养基所需补充剂混合物，用于内皮细胞预培养：胎牛血清0.02 mL/mL，内皮细胞生长补充剂0.004 mL/mL，表皮生长因子0.1 ng/mL，碱性成纤维细胞生长因子1 ng/mL，肝素90 µg/mL，氢化可的松1 µg/mL |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | 在ECGM基础上添加5% [w/w] FCS和1 mM硫酸镁，以增强细胞黏附 |
| 内皮细胞生长培养基（ECGM，即用型） | Promocell | C-22010 | HUVEC细胞培养基，已包含所有补充剂组分 |
| 胎牛血清（FCS） | Biochrome 现为 Merck | S 0415 | 细胞培养补充剂，用于感染分析 |
| FITC标记的山羊抗人VWF抗体 | Abcam | ab8822 | 储存浓度：10 mg/mL，用于在流动条件下对球状及多聚体VWF进行免疫检测 |
| 流体单元 | Ibidi | 10903 | 用于流动培养的流体单元 |
| 明胶（猪源） | Sigma Aldrich | G-1890-100g | 用于微载片通道表面的预包被 |
| 盐酸组胺（Histamine dihydrochloride） | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | 用于诱导内皮细胞Weibel-Palade小体分泌VWF |
| 人脐静脉内皮细胞（HUVEC） | Promocell | C-12203 批号：396Z042 | 来自多个供体的原代内皮细胞，以液氮冷冻保存 |
| 小鼠源性人VWF特异性抗体（单克隆） | Santa Cruz | sc73268 | 储存浓度：200 µg/mL，用于PFA固定后在微流控载片中对VWF进行免疫染色 |
| 注射端口 | Ibidi | 10820 | 用于在循环流动过程中向储液管路中注入组胺或细菌 |
| Luer型I0.4微流控载片（ibiTreat472microslides） | Ibidi | 80176 | 经物理改性的载片，适用于流体培养（μ–Slide I0.4 Luer，通道高度0.4 mm，通道体积100 μL，生长面积2.5 cm，包被面积25.4 cm²），适用于各类流动实验；物理处理可形成亲水性和黏附性表面 |
| 硫酸镁（MgSO₄，无水） | Sigma Aldrich | M7506-500G | 用于配制ECGMS培养基 |
| 微流控泵 | Ibidi | 10905 | 气压泵 |
| 灌注套装 | Ibidi | 10964 | 黄色/绿色灌注套装，管路内径1.6 mm，管长50 cm，总工作体积13.6 mL，死体积2.8 mL，储液器容量10 mL。与μ-slide L0.4 Luer联用，在37°C、黏度为0.0072 dyn × s/cm2条件下，可实现3.8 mL/min至33.9 mL/min的流速范围，剪切应力介于3.5 dyn/cm²至31.2 dyn/cm²之间，适用于50 cm长度的微流控系统 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 使用以下试剂配制：0.2 g/L KCl，1.44 g/L Na₂HPO₄，0.24 g/L KH₂PO₄，pH 7.4 | ||
| 氯化钾（KCl） | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | 用于PBS缓冲液的配制 |
| 泵控制软件（PumpControl v1.5.4） | Ibidi | v1.5.4 | 用于控制压力泵、设定流动条件并启动/终止流动的计算机软件 |
| 表达RFP的肺炎链球菌 | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | 表达RFP（与组蛋白样蛋白融合）并整合至基因组的47型肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） |
