在恒定培养基流量下评估肺炎球菌与原代人内皮细胞的附着

摘要

资料来源： Jagau， H. et al.恒流原代人内皮细胞的肺炎球菌感染。 J. Vis. Exp.（2019年）

该视频演示了在恒定培养基流动条件下肺炎球菌附着在内皮细胞上血管性血友病因子 （VWF） 串的实时可视化。它概述了刺激 VWF 释放、标记字符串和量化细菌结合的步骤。

方案

1. 血管性血友病因子（VWF）的诱导释放和多聚化VWF弦的可视化

1. 保持流动设置，因为需要 10 dyn/cm² 的剪应力才能触发 VWF 多聚到高达 200 MDa 的长串。通过将 136 μL 100 mM 组胺储备溶液注射到内皮细胞生长培养基中，使用注射口在灌注管中循环补充剂混合物 （ECGMS） 培养基，诱导内皮 WPB 释放 VWF。流动介质中组胺的最终浓度为 1 mM。如果没有可用的进样口，可以通过移液到泵储液器的介质中来替代添加组胺。
2. 对于多聚化VWF串的免疫荧光检测，当达到储液器中的平衡培养基水平时停止流动，并使用进样口将20μg体积为200μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）的VWF特异性异硫氰酸荧光素（FITC）偶联抗体注射到循环的13.6mL ECGMS培养基中。如果没有可用的进样口，可以通过移液到泵储液器的培养基中来替代添加抗体。这导致最终抗体浓度为 1.3 μg/mL。
3. 要在短时间内对多个视场进行显微扫描，请使用显微镜的荧光装置，配备 30% 功率的氙气荧光设备和落射荧光相机。使用明场模式监测人脐静脉内皮细胞（HUVEC）层的形状和形态，以选择适合VWF字符串可视化的代表性细胞。
4. 要对绿色荧光 VWF 串进行可视化，请在显微镜软件 （LasX） 的荧光单元菜单中选择 63x/1.40 油物镜和 470 nm 检测滤光片。创建至少 50 个代表性现场视图的 Z 堆栈快照，每个视图包含大约 10 个形态完整的 HUVEC。为了量化不同时间点的绿色荧光 VWF 字符串，请扫描多个视场。

2. 实时对流动中细菌附着在VWF串上的显微镜评估

1. 通过免疫荧光检测量化肺炎球菌与HUVEC细胞表面产生的VWF串的附着。
   1. 保持流量并使用进样口将最大体积为 1 mL 的 1.35 x 10⁸ CFU/mL 表达红色荧光蛋白 （RFP） 的肺炎球菌注射到 ECGMS 培养基中。或者，将细菌移液到泵储液器中的培养基中。以 10 dyn/cm² 重新启动剪切应力，让细菌在泵系统内循环。
   2. 选择 63 倍油浸物镜进行显微镜放大，并将显微镜软件中的荧光滤光片设置调整为 RFP 通道（540 nm 检测滤光片），以检测表达 RFP 的肺炎球菌。
   3. 为了量化细菌附着在VWF字符串上，停止流动并创建至少30个代表性场视图的Z堆栈快照，每个视图包含大约10个形态上完整的HUVEC，并计算肺炎球菌的数量。
   4. 使用方差分析单因子统计算法来评估数据，然后进行事后双尾未配对样本检验以进行详细的统计比较。P 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

材料