利用斑马鱼胚胎进行植入物相关细菌感染的体内分析

摘要

来源：Zhang, X. et. al., 一种用于活体可视化和原位分析生物材料相关Staphylococcus aureus感染的斑马鱼胚胎模型。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种用于研究与植入性生物材料相关感染的斑马鱼胚胎模型。通过显微注射 金黄色葡萄球菌 使用聚苯乙烯微球可增强细菌存活，证实了植入材料在促进感染方面的作用。

方案

1. 细菌悬液及细菌-微球悬液的制备

注意： 的 金黄色葡萄球菌 表达mCherry荧光蛋白的RN4220菌株（S. aureus-mCherry）被使用。该 S. aureus RN4220菌株的毒力调控基因发生突变 agrA （辅助基因调节子A），因此在斑马鱼胚胎模型中可能具有相对较低的毒力。其他金黄色葡萄球菌（S. aureus 可用于生物材料相关感染（BAI）的菌株或其他细菌种类。

1. 从添加了 10 µg/mL 氯霉素的胰蛋白胨大豆琼脂培养板上挑取 4 至 5 个 S. aureus RN4220 菌落，在 10 mL 添加了 10 µg/mL 氯霉素的胰蛋白胨大豆肉汤中，于 37 °C 摇床培养至对数生长期中期。
   1. 培养过程中，取 100 µL 细菌悬液加入 900 µL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，置于光径为 1 cm 的比色皿内，测定 620 nm 处的光密度（OD₆₂₀）。继续培养细菌直至 OD₆₂₀ 达到 0.4–0.8。
      注意： OD₆₂₀ 为 0.1 时通常相当于 3.0 × 10⁷ 菌落形成单位（CFU）/mL 的 S. aureus。处于对数生长期中期的细菌接种物其 OD₆₂₀ 应在 0.4–0.8 之间。其他细菌种类和菌株可能需要不同的培养时间。
2. 将细菌在 3,500 × g 条件下离心 10 分钟，弃上清，用 1 mL 无菌 PBS 重悬菌体沉淀。随后用无菌 PBS 洗涤细菌两次，最后将细菌重悬于 1.1 mL 含 4%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮40（PVP40）的 PBS 溶液中。
3. 涡旋该细菌悬液，取 100 µL 悬液加入 900 µL 无菌 PBS 中，置于比色皿内测定 OD₆₂₀。用 PVP40 溶液调节细菌悬液浓度。此即为“仅含细菌”的悬液。
4. 可自由选择生物材料与细菌悬液混合。本研究中使用市售聚苯乙烯（PS）微球（蓝色荧光，10 µm）。为制备细菌-微球悬液，将微球在室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清，将微球重悬于“仅含细菌”的悬液（PVP40 溶液中）。
5. 为确保在有或无微球存在时注射的细菌剂量大致相等，细菌-微球悬液的浓度应为“仅含细菌”悬液浓度的三分之二。可通过向细菌-微球悬液中加入 0.5 倍体积的 PVP40 溶液实现稀释。使用涡旋振荡器充分混匀悬液。需注意，该比例（三分之二）已针对 S. aureus 进行过评估，同样适用于 S. epidermidis，但对于其他细菌种类，或使用不同于 10 µm 尺寸或非微球形状的生物材料时，建议验证该比例是否仍然适用。
6. 通过10倍系列稀释的定量培养法检测“仅含细菌”悬液和细菌-微球悬液的浓度：取 100 µL 悬液加入 96 孔板中，通过将 10 µL 悬液转移至 90 µL 无菌 PBS 中进行系列稀释。将未稀释及稀释后的悬液各取 10 µL 双份点样于琼脂平板上，37 °C 过夜培养，计数菌落并计算细菌数量（菌落形成单位，CFU）。

2. 斑马鱼胚胎的繁殖、采集与维护

1. 按照斑马鱼胚胎繁殖、收集和培养的一般操作流程进行，具体修改如下：在养殖箱中将野生型Tupfel长鳍（TL）斑马鱼品系或选定的转基因品系斑马鱼（本实验中为Mpeg1:Kaede）进行交配，加入隔离网，待光照开启后诱导成年雌鱼产卵，随后将成年鱼与所产卵分离。
2. 次日收集胚胎，并剔除不透明的非存活胚胎。将约60个胚胎置于直径100 mm的培养皿中，使用E3培养基在28 °C条件下培养。每日清除死亡及异常胚胎，并更换新鲜E3培养基。

3. 注射针头的准备

1. 使用拉针仪制备用于注射的玻璃微量移液针。设置参数如下：加热温度：772，拉力：100，速度：200，时间：40，气压：75。
2. 在显微镜下利用目镜中的标尺，用镊子在微针外径约为20 µm的位置（适用于10 µm微球）折断针尖。应避免使用开口过大的微针，因其会降低胚胎存活率。
   注意：可根据待注射生物材料的大小和形状，选择更小或更大的针尖开口。文献报道，使用开口约50 µm的微针进行注射会导致胚胎存活率显著下降。

4. 将仅含细菌或含细菌-微球悬浮液注射到斑马鱼胚胎中

1. 使用微波炉加热琼脂糖溶液（1–1.5% (wt)，溶于去离子水），倒入100 mm培养皿中。将塑料模具模板放置在培养皿内的琼脂糖溶液表面，以在琼脂糖中形成凹槽，用于准确定位胚胎并便于注射。室温孵育，待琼脂糖溶液凝固后移除模具。
2. 受精后3天，将胚胎置于含有0.02% (w/v) 3-氨基苯甲酸（Tricaine）的100 mm培养皿中进行麻醉。5分钟后，将胚胎转移至覆盖有含0.02% (w/v) Tricaine E3培养基的琼脂糖板上，并将其排列成同一方向以便注射。对于Mpeg1:Kaede转基因品系，首先在含0.02% (w/v) tricaine的E3培养基中麻醉胚胎，然后使用体视荧光显微镜筛选表达绿色荧光蛋白的胚胎。
3. 使用微量移液器吸头将约10 µL的“仅细菌”或“细菌-微球”悬浮液吸入注射针中。将注射针安装到连接显微注射仪的显微操作器上。对于本实验所用的注射仪（见材料表），注射2–3 nL时采用以下参数：压力：300–350，回压：0，时间：2 ms。注意：显微注射仪的参数设置取决于所使用的仪器型号。当注射与其他形状或尺寸的生物材料混合的细菌时，可能需要调整注射参数。
   1. 对“仅细菌”悬浮液和“细菌-微球”悬浮液的注射应使用相同口径的注射针。若注射针断裂或堵塞，须立即更换新针以进行后续注射。
4. 在光学显微镜下将注射针以45–60°角插入胚胎的肌肉组织（图1）。通过轻微前后移动调整注射针在组织中的位置，并使用连接显微注射仪的脚踏开关进行注射。
5. 注射荧光标记细菌后，在体视荧光显微镜下评估胚胎是否成功感染。剔除评分阴性者（未见荧光标记细菌或荧光微球）。将阳性胚胎单独维持在48孔板的E3培养基中，每日更换培养基。

5. 胚胎破碎、显微镜观察评分及细菌定量培养

1. 注射后立即开始，使用体视荧光显微镜在显微镜下对所有胚胎进行评分，检测是否存在荧光细菌，并在随后的每一天继续观察，直至随机选取胚胎进行定量培养。
2. 注射后不久，随机选取少量存活的感染胚胎（本研究中为5至6个），使用无菌吸头将其分别转移至独立的2 mL微量离心管中。去除培养基，用无菌PBS轻轻洗涤胚胎一次，然后加入100 µL无菌PBS。
3. 向每管中加入2–3颗无菌氧化锆珠（直径2 mm），使用匀浆器（见材料表）以3,500 rpm速度研磨30秒。按照步骤1.3所述方法对匀浆液进行定量培养。
   注意：其他类型的匀浆器可能需要不同的参数设置。
4. 在注射后的后续各天，随机选取多个胚胎，按照步骤5.3进行定量培养。

结果

图1：将细菌-微球悬浮液共注射到斑马鱼胚胎尾部肌肉的示意图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白酶大豆琼脂	BD Difco	236950	AMC 媒体制备单元
胰蛋白酶大豆肉汤	BD Difco	211825
聚乙烯吡咯烷酮40	Applichem	A2259.0250
10 µm 直径聚苯乙烯微球（蓝色荧光）	Life technology/ThemoFisher	F8829
玻璃微毛细管（外径 1 mm × 内径 0.78 mm）	Harvard Apparatus	30-0038
微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Inc	Flaming p-97
光学显微镜 LM 20	Leica	MDG33 10450123
3-氨基苯甲酸（Tricaine）	Sigma-Aldrich	E10521-50G
低熔点琼脂糖	Roche	11388991001
立体荧光显微镜 LM80	Leica	MDG3610450126
Microloader 移液器吸头	Eppendorf	5242956.003
M3301 型微操纵器配 M10 支架	World Precision Instruments	00-42-101-0000
FemtoJet express 微注射仪	Eppendorf	5248ZO100329
2 ml 聚丙烯微量离心管	Sarstedt	72.693.005
氧化锆珠	Bio-connect	11079124ZX
MagNA 裂解仪	Roche	41416401
氯霉素	Sigma-Aldrich	C0378
旋转摇床（用于细菌培养）	New Brunswick Scientific	G10
斑马鱼培养箱	VWR	Incu-line
比色皿	BRAND	759015
离心机	Hettich-Zentrifugen	ROTANTA 460R
分光光度计	Pharmacia biotech	Ultrospec®2000
镊子	Sigma-Aldrich	F6521-1EA
48 孔板	Greiner bio-one	677180
96 孔板	Greiner bio-one	655161
培养皿	Falcon	353003
培养皿	Biomerieux	NL-132