一种检测产硫化氢细菌的灵敏可视化方法

摘要

来源：Zhu, W., & Chu, W. 检测产硫化氢细菌的灵敏可视化方法。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种灵敏的可视化方法，用于快速检测产硫化氢细菌。颜色由黄色变为黑色，表明细菌通过生成硫化铋产生了活性。

方案

1. 细菌菌株

注意：本实验使用了九种标准菌株，包括Salmonella paratyphi A、Salmonella paratyphi B、Fusobacterium nucleatum、Enterococcus faecalis、Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa PAO1、Aeromonas hydrophila YJ-1、Proteus vuigaris 和 Klebsiella pneumoniae。Salmonella paratyphi A、Fusobacterium nucleatum、Pseudomonas aeruginosa 和 Proteus vuigaris 能够产生 H₂S。

1. 细菌培养物的制备
   1. 转移一个细菌菌落 伤寒沙门菌副伤寒血清型 A, 伤寒沙门菌 B, Enterococcus faecalis, 金黄色葡萄球菌 aureus, 铜绿假单胞菌 PAO1 Aeromonas hydrophila YJ-1，以及 肺炎克雷伯菌 从LB（Luria-Bertani）琼脂平板接种至100 mL LB液体培养基中，于37 °C培养12–16小时，直至菌液浓度约为1 × 10⁹ 细胞/mL（由OD指示）₆₀₀ = 1).
   2. 转移一个细菌菌落 具核梭杆菌 nucleatum 和 普通变形杆菌 从胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）琼脂平板接种至100 mL TSB培养基中，于37 °C厌氧条件下培养24 h，直至细菌浓度约为1 × 10⁹ 细胞/mL（由OD指示）₆₀₀ = 1).

2. H₂S 检测实验

1. 硫化氢产生试验
   1. 在96孔微孔板中，将100 µL细菌培养物与100 µL新配制的铋溶液（pH 8.0；10 mM三氯化铋、0.4 M三乙醇胺盐酸盐、20 mM吡哆醛-5'-磷酸一水合物、20 mM EDTA（乙二胺四乙酸）和40 mM L-半胱氨酸）混合，并在37 °C下培养20分钟。每种细菌菌株均需设三个重复。
   2. 20分钟后，观察颜色变化。若溶液颜色由浅黄色变为黑色，则表明该细菌能够产生H₂S。此检测需重复三次。
2. 方法的灵敏度
   1. 使用不同浓度的硫氢化钠（NaHS）：2 mM、1 mM、0.8 mM、0.6 mM、0.4 mM、0.2 mM、0.1 mM和0 mM，与BS（硫化铋）溶液混合，以确定该方法的检测灵敏度。
   2. 通过观察是否形成黑色BS沉淀来判断HS⁻/S²⁻的存在。采用视觉评分法对各孔颜色进行评分，评分标准从无颜色产生（-）到最深黑色产生（++++++）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三氯化铋（III）	上海麦克林生化科技有限公司	7787-60-2
EDTA	南京化学试剂股份有限公司	60-00-4
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
L-半胱氨酸	Amresco	52-90-4
三乙醇胺盐酸盐	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	637-39-8
硫氢化钠
移液器