单细胞细菌接种物的制备

摘要

来源：Niu, L., 等，通过活体显微镜观察结核分枝杆菌感染期间斑马鱼胚胎中巨噬细胞的溶解性细胞死亡。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了如何从对数生长后期的Mycobacterium marinum培养物中制备单细胞悬液，以用于感染实验及后续应用，并确保实验的一致性。

方案

1. Mycobacterium marinum 单细胞接种物的制备（图1）

1. 从 -80 °C 取出含天蓝色荧光蛋白的Mycobacterium marinum甘油菌种，接种于含有 10% (v/v) OADC（油酸、白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶）、0.25% 甘油和 50 μg/mL 潮霉素的 7H10 琼脂平板上。在 32 °C 下培养约 10 天。
2. 挑选发出阳性荧光的单菌落，接种至 3 mL 含 10% OADC、0.5% 甘油和 50 μg/mL 潮霉素的 7H9 培养基中。
   1. 在 32 °C、100 转/分钟（rpm）条件下培养 4–6 天，直至菌液进入对数生长期（OD₆₀₀ = 0.6–1.0）。
   2. 将菌液按 1:100 比例转接至 30 mL 新鲜 7H9 培养基中，培养基含 10% OADC、0.5% 甘油、0.05% Tween-80 和 50 μg/mL 潮霉素，继续培养至 OD₆₀₀ 达到约 1.0。
      注意：为获得最佳培养质量，建议进行此传代步骤。根据我们的经验，若直接将菌种接入大量培养基中，易导致细菌聚集成团。
3. 按以下步骤收集M. marinum菌体。
   1. 以 3,000 x g 离心 10 分钟收集M. marinum菌体沉淀。弃去上清液，仅保留 300 μL 用于重悬菌体沉淀。
   2. 加入含 10% 甘油的 3 mL 7H9 培养基进一步重悬菌体沉淀，随后在水浴中超声处理，设置为 100 W，开启 15 秒，关闭 15 秒，总时长 2 分钟。
      注意：超声处理旨在获得单细胞均一悬液，以防止显微注射针头堵塞。
4. 将细菌悬液转移至 10 mL 注射器中，并通过 5 μm 滤膜过滤以去除菌团。
5. 使用分光光度计测定悬液的光密度（OD），并用含 10% 甘油的 7H9 培养基稀释至 OD₆₀₀ = 1.0。将悬液分装为每份 10 μL，置于 -80 °C 冰箱中保存以备后续使用。
6. 通过系列稀释法将细菌原液在含 10% (v/v) OADC、0.5% 甘油和 50 μg/mL 潮霉素的 7H10 琼脂平板上进行涂布培养，以确认接种物的细菌浓度（cfu/mL）。

结果

图1：单细胞细菌制备的示意图。 按照所述流程制备单细胞天蓝色荧光标记的Mycobacterium marinum菌种。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 吐温-80	Sigma	P1379
10 mL 注射器	Solarbio	YA0552
10% OADC	BD	211886
5 μm 滤膜	Mille X	SLSV025LS
50 μg/mL 潮霉素	Sangon Biotech	A600230
7H10	BD	262710
7H9	BD	262310
环境培养箱	Pecon	Temperature control 37-2 digital
Eppendorf 微量移液器吸头	Eppendorf	No.5242956003
甘油	Sangon Biotech	A100854
培养箱	Keelrein	PH-140(A)
Mycobacterium marinum			ATCC BAA-535
超声破碎仪	SCICNTZ	JY92-IIDN
分光光度计（OD600）	Eppendorf AG	22331 Hamburg