从大鼠肺内皮细胞细菌感染后获取细胞毒性淀粉样蛋白

摘要

来源： Balczon, R., 等 检测肺内皮细胞感染后细胞毒性淀粉样蛋白的方法 铜绿假单胞菌. 实验视频杂志 (2018)

本视频演示了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染肺内皮细胞后，从细胞培养上清中制备细胞毒性物质的操作流程。详细说明了细菌效应蛋白如何破坏宿主细胞结构，并诱导细胞毒性淀粉样寡聚体释放到上清液中的机制。

方案

1. 细胞毒上清液的制备：

大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养物由南阿拉巴马大学肺生物学中心细胞培养核心实验室提供。

1. 为制备细胞毒性上清液，将 2 × 10⁶ 个细胞接种至各自的 150 cm 培养皿中，培养 3–4 天，直至细胞达到汇合状态。每次实验使用两个培养皿。
2. 为产生上清液，用磷酸盐缓冲液洗涤两个 PMVEC 培养皿中的一个，进行胰酶消化后计数细胞。用 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）洗涤另一个 PMVEC 培养皿，然后以感染复数（MOI）为 20:1 的比例接种两种 Pseudomonas aeruginosa 菌株之一。具体操作如下：
   1. 对于 P. aeruginosa，OD₅₄₀ 0.25 相当于 2 × 10⁸ CFU/mL。为配制该浓度，向一个 1 mL 一次性比色皿中加入 1 mL HBSS，从平板上刮取足够量的细菌，直至使用分光光度计测得 OD₅₄₀ 为 0.25。下一步将计算所需细菌量。
   2. 确定培养皿中 PMVEC 的细胞数量后，计算应加入第二个未经胰酶消化的 PMVEC 培养皿中的细菌数量。例如，若测得 PMVEC 培养皿中含有 1.3 × 10⁷ 个细胞....

结果

图1. P. aeruginosa 接种对肺微血管内皮细胞形态的影响。肺微血管内皮细胞在接种P. aeruginosa PA103菌株前（A）和接种后4小时（B）的融合单层。在感染后的细胞单层中可明显观察到细胞间隙。比例尺 = 100 µm

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HBSS	Gibco	14025-092
PBS	Gibco	10010-023
0.22 微米注射器滤器	Millipore	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen	C10277
微量离心浓缩管 - 10,000 分子量截断	Millipore	UFC801008
菌株 PA103 和 ΔPcrV			这些铜绿假单胞菌菌株由美国威斯康星大学医学院 Dara Frank 博士惠赠，威斯康星州密尔沃基市
琼脂	Fisher	BP1423-500
胎牛血清	Hyclone	SH30898.03IH
青霉素-链霉素溶液（PenStrep）	Gibco	15070063