利用生物发光技术追踪小鼠体内细菌感染动态

摘要

来源： Valentine, M. E., 等 框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的小鼠感染模型中检测毒力减弱情况。 J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了利用生物发光技术在活体小鼠中可视化并比较毒力菌株与减毒菌株的行为。视频概述了生物发光菌液的制备及其对小鼠的腹腔注射过程。毒力菌株表现出系统性扩散，而减毒菌株则局限于局部并逐渐被清除，后者表现为发光信号逐渐减弱。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 通过注射对动物进行菌株接种
   1. 在注射当天早晨，取出待测菌株的冻存管，在 4 °C 下解冻 3–4 小时。每只待注射小鼠准备 0.5 mL。解冻后立即将冻存管置于冰上，并在 2 小时内完成小鼠注射。
   2. 解冻后，将每支冻存管中的菌液转移至新的 2 mL 离心管中，在 4,500 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，并将菌体沉淀重悬于 1 mL 的 1× PBS（磷酸盐缓冲液）中。
   3. 再次在 4,500 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，将沉淀用 1× PBS 重悬，调整终浓度为 2.5 × 10⁹ CFU/mL（CFU：菌落形成单位）。不同菌株所需 1× PBS 的具体体积可能略有差异。
      1. 从每种菌株的最终悬液中取 3 份样品，按照前述方法验证 CFU/mL、基因型和表型。
   4. 针对每种菌株，将 1.5 mL PBS/菌悬液分装至每 5 只小鼠使用一支 2 mL 离心管，以减少反复开启同一管造成的污染风险。同时，准备用于对照注射的 1× PBS 管。
   5. 准备小鼠（本实验每组 10 只雄性和 10 只雌性 C57BL/6 小鼠）及注射所需材料（注射器、针头、锐器盒、记号笔、纸笔等.），转移至无菌动物手术室，并用消毒湿巾擦拭所有操作表面。
      1. 为避免小鼠应激及实验人员受伤，每次仅将一种性别和实验组的小鼠带入手术室（例如，一次带入 10 只雄性小鼠用于特定菌株感染）。佩戴两副乳胶手套，以防被咬破；同时穿戴实验服、护目镜和口罩，防止污染。
   6. 首先对对照组小鼠注射 1× PBS，以确认注射操作本身是否会引起不良反应。
      1. 从笼中取出一只小鼠，每次仅取出一只。
      2. 称量小鼠体重，并用永久性记号笔在其尾部做标记，以便后续追踪注射后的体重变化。
      3. 打开一支新的 1 mL 注射器和 27 G 针头（每只小鼠使用新的注射器和针头，防止交叉污染），注射 200 µL 无菌 1× PBS。
         1. 用拇指和食指抓住小鼠耳后部，捏起颈部背侧皮肤形成皱褶以固定——皱褶越紧，小鼠颈部活动越少，注射过程中被咬伤的风险也越低。用小指将尾巴固定在掌心，使小鼠身体平贴，减少移动。
         2. 将小鼠翻转，以 30° 角将针头插入腹中线左侧或右侧的腹腔内。针头进入后轻微上抬，确保已进入腹腔而非刺入器官。缓慢注入 PBS 后拔出针头。
         3. 将使用过的针头放入指定的生物危害锐器盒中，不得重复使用注射器或针头。注射部位出现局部隆起（药液团块）属正常现象。
      4. 注射完成后，将小鼠转移至另一个笼子中。
      5. 对下一只小鼠重复上述操作。当同一笼小鼠全部注射完毕后，立即将其放回原笼。
   7. 完成对照组注射后，按照相同操作流程开始对实验组小鼠注射待测菌株悬液。
      1. 每只小鼠注射 200 µL 菌悬液。当菌悬液起始浓度为 2.5 × 10⁹ CFU/mL 时，每只小鼠接种剂量为 5 × 10⁸ CFU。
         注意：上述浓度是通过前期动物实验优化确定的各菌株致死剂量。其他菌株或物种可能需要调整剂量。
   8. 所有注射完成后，将小鼠送回饲养室以减轻应激反应，并用消毒湿巾清洁操作区域。
   9. 注射后密切监测动物死亡情况：在 72 小时内每 3 小时检查一次笼内是否有死亡小鼠，之后 10 天内每 12 小时检查一次。每 12 小时记录一次小鼠体重，评估因疾病导致的体重下降情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL 平盖管	赛默飞世尔科技	AB-0620	通过 Fisher Scientific
1 mL 注射器	BD	22-253-260	通过 Fisher Scientific
1.5 mL 微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 mL 冻存管	康宁	430659	通过 Fisher Scientific
27G针头	BD	14-821-13B	通过 Fisher Scientific
台式离心机 5804R	Eppendorf	04-987-372	通过 Fisher Scientific
台式微量离心机	Sorvall	75-003-287	通过 Fisher Scientific
IVIS Lumina XRMS Series III 活体成像系统	珀金埃尔默	CLS136340
磷酸盐缓冲液粉末	Sigma	P3813-10PAK	Sigma-Aldrich