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所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
- 通过注射对动物进行菌株接种
- 在注射当天早晨，取出待测菌株的冻存管，在 4 °C 下解冻 3–4 小时。每只待注射小鼠准备 0.5 mL。解冻后立即将冻存管置于冰上，并在 2 小时内完成小鼠注射。
- 解冻后，将每支冻存管中的菌液转移至新的 2 mL 离心管中，在 4,500 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，并将菌体沉淀重悬于 1 mL 的 1× PBS（磷酸盐缓冲液）中。
- 再次在 4,500 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，将沉淀用 1× PBS 重悬，调整终浓度为 2.5 × 109 CFU/mL（CFU：菌落形成单位）。不同菌株所需 1× PBS 的具体体积可能略有差异。
- 从每种菌株的最终悬液中取 3 份样品，按照前述方法验证 CFU/mL、基因型和表型。
- 针对每种菌株，将 1.5 mL PBS/菌悬液分装至每 5 只小鼠使用一支 2 mL 离心管，以减少反复开启同一管造成的污染风险。同时，准备用于对照注射的 1× PBS 管。
- 准备小鼠（本实验每组 10 只雄性和 10 只雌性 C57BL/6 小鼠）及注射所需材料（注射器、针头、锐器盒、记号笔、纸笔等.），转移至无菌动物手术室，并用消毒湿巾擦拭所有操作表面。
- 为避免小鼠应激及实验人员受伤，每次仅将一种性别和实验组的小鼠带入手术室（例如，一次带入 10 只雄性小鼠用于特定菌株感染）。佩戴两副乳胶手套，以防被咬破；同时穿戴实验服、护目镜和口罩，防止污染。
- 首先对对照组小鼠注射 1× PBS，以确认注射操作本身是否会引起不良反应。
- 从笼中取出一只小鼠，每次仅取出一只。
- 称量小鼠体重，并用永久性记号笔在其尾部做标记，以便后续追踪注射后的体重变化。
- 打开一支新的 1 mL 注射器和 27 G 针头（每只小鼠使用新的注射器和针头，防止交叉污染），注射 200 µL 无菌 1× PBS。
- 用拇指和食指抓住小鼠耳后部，捏起颈部背侧皮肤形成皱褶以固定——皱褶越紧，小鼠颈部活动越少，注射过程中被咬伤的风险也越低。用小指将尾巴固定在掌心，使小鼠身体平贴，减少移动。
- 将小鼠翻转，以 30° 角将针头插入腹中线左侧或右侧的腹腔内。针头进入后轻微上抬，确保已进入腹腔而非刺入器官。缓慢注入 PBS 后拔出针头。
- 将使用过的针头放入指定的生物危害锐器盒中，不得重复使用注射器或针头。注射部位出现局部隆起（药液团块）属正常现象。
- 注射完成后，将小鼠转移至另一个笼子中。
- 对下一只小鼠重复上述操作。当同一笼小鼠全部注射完毕后，立即将其放回原笼。
- 完成对照组注射后，按照相同操作流程开始对实验组小鼠注射待测菌株悬液。
- 每只小鼠注射 200 µL 菌悬液。当菌悬液起始浓度为 2.5 × 109 CFU/mL 时，每只小鼠接种剂量为 5 × 108 CFU。
注意：上述浓度是通过前期动物实验优化确定的各菌株致死剂量。其他菌株或物种可能需要调整剂量。
- 所有注射完成后，将小鼠送回饲养室以减轻应激反应，并用消毒湿巾清洁操作区域。
- 注射后密切监测动物死亡情况：在 72 小时内每 3 小时检查一次笼内是否有死亡小鼠，之后 10 天内每 12 小时检查一次。每 12 小时记录一次小鼠体重，评估因疾病导致的体重下降情况。