生成用于靶向基因敲除的Pseudomonas aeruginosa双交换重组子

摘要

来源：Valentine, M. E., 等。在Pseudomonas aeruginosa中构建框内基因缺失突变体并利用简单小鼠感染模型检测毒力减弱。可视实验杂志（2020）。

本视频演示了利用基于质粒的基因缺失策略在Pseudomonas aeruginosa中产生双交换重组子的方法。该过程包括筛选通过单交换将非复制型质粒整合到基因组中的细菌，随后在蔗糖筛选条件下诱导第二次重组事件以切除质粒。通过抗生素抗性的丢失以及在含蔗糖培养基上生长的能力，可确认双交换重组的成功发生。

方案

1. 双交换重组子的检测 P. aeruginosa

1. 对于每种肉汤培养物，取10 µL培养液接种至预先温育的PIA（Pseudomonas 分离琼脂）平板上，该平板添加10%蔗糖（不含甘油），并划线以获得单菌落。于37 °C培养过夜。
2. 次日，从培养箱中取出平板并检查生长情况。蔗糖抗性菌落应为双交换重组子（即：通过质粒插入片段的另一同源区域与P. aeruginosa染色体之间的重组事件，已将质粒从染色体上切除）。
   1. 用无菌牙签挑取至少20个菌落，分别点种到预先温育的以下三种平板上：1）PIA，2）添加10%蔗糖（不含甘油）的PIA，3）添加300 µg/mL羧苄西林的PIA。
3. 于37 °C培养过夜。
4. 从培养箱中取出平板，观察菌落生长情况。真正的双交换重组子应表现为对羧苄西林敏感且具有蔗糖抗性（即：能在PIA和添加蔗糖的PIA上生长，但不能在添加羧苄西林的PIA上生长的菌落）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卡那霉素单硫酸盐	Fisher Scientific	BP906-5
LE 琼脂糖	Genemate	3120-500	通过 Fisher Scientific 购买
LB 培养基（Luria Broth）	Difco	240230	通过 Fisher Scientific 购买
MicroPulser 电穿孔仪	BioRad	1652100
高纯度 Noble 琼脂	Affymetrix/USB	AAJ10907A1	通过 Fisher Scientific 购买
磷酸盐缓冲液粉末	Sigma	P3813-10PAK	Sigma-Aldrich
假单胞菌分离琼脂	Difco	292710	通过 Fisher Scientific 购买
假单胞菌分离肉汤	Alpha Biosciences	P16-115	定制批次
摇床培养箱	New Brunswick Scientific	Innova 4080	以 200 rpm 振荡
小型培养皿（100 O.D. × 10 mm）	Fisher Scientific	FB0875713
SmartSpec Plus 分光光度计	Bio-Rad	170-2525	或选用其他方法/供应商
蔗糖	Fisher Scientific	S5-500