从液体培养物中制备与分离委内瑞拉链霉菌孢子

摘要

来源：Schlimpert, S.，等．利用微流控装置对S. venezuelae完整生命周期进行荧光延时成像．J. Vis. Exp. （2016）

本视频展示了从委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）中培养并分离孢子的方法。孢子是细菌在营养受限条件下产生的一种休眠细胞，有助于细菌在逆境中存活，可通过离心收集。该方法可获得纯净且可低温保存的孢子悬液，适用于后续实验应用。

方案

1. 新鲜Streptomyces venezuelae孢子的分离及用尽培养基的制备

1. 在30 ml麦芽糖-酵母提取物-麦芽提取物（MYM）培养基中接种10 µl SV60菌株的孢子[attBϕBT1::pSS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]，并添加60 µl R2微量元素溶液（TE）。为确保细胞生长和产孢的一致性，应使用带挡板的锥形瓶或内置弹簧的锥形瓶，以保证充分通气。
2. 在30 °C、250 rpm条件下培养细胞35–40小时。
3. 采用液体封片相差显微镜观察细胞。此时可见菌丝片段和孢子。
4. 取1 ml细胞悬液，在台式离心机中以400 × g离心1分钟，使菌丝体和较大的细胞碎片沉淀。
5. 将含有孢子悬浮液的约300 µl上清液转移至新的1.5 ml离心管中，置于冰上。保留剩余的培养基。
6. 用MYM-TE培养基将孢子稀释至1:20（终浓度：0.5–5 × 10⁷ 孢子/ml），并在使用前保持在冰上。
   注意：尽管目前尚不完全清楚触发链霉菌（Streptomyces）产孢的确切条件，但使用含有产孢培养物所释放的未知胞外信号分子的耗尽型MYM-TE培养基可促进产孢。
7. 将保留的培养基10 ml通过滤膜除菌，以获得无孢子和菌丝片段的耗尽型MYM-TE培养基。使用无菌的0.22 µm注射器滤器，并将除菌后的耗尽型MYM-TE转移至无菌的15 ml离心管中。
8. 若需进行类似生长条件的后续实验，可将制备好的耗尽型MYM-TE在4 °C保存数天。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麦芽糖-酵母提取物-麦芽提取物（MYM）4 g 麦芽糖4 g 酵母提取物10 g 麦芽提取物加入1 L H2O（50%自来水和50%反渗透水），高压灭菌后每100 ml添加200 ml R2微量元素溶液			用于培养Streptomyces venezuelae SV60的孢子形成培养基
R2微量元素溶液（TE）8 mg ZnCl240 mg FeCl3-6H2O2 mg CuCl2-2H2O2 mg MnCl2-4H2O2 mg Na2B4O7-10H2O2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O加入200 ml H2O高压灭菌并在4 °C下保存			向MYM中加入0.002体积的R2微量元素溶液
PBS（磷酸盐缓冲盐水）	Sigma	P4417-100TAB	用于填充B04A板中未使用通道的进样孔，以便准备平板进行短期储存
0.22 µm 注射器滤器	Sartorius stedim	16532-K	制备用过的MYM-TE