荧光延时成像观察Streptomyces venezuelae的生活周期

摘要

来源：Schlimpert, S. 等。利用微流控装置对S. venezuelae完整生命周期进行荧光延时成像。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了利用微流控装置对细菌Streptomyces venezuelae的完整生命周期进行荧光延时成像，实时观察其萌发、菌丝生长和孢子形成过程。

方案

1. 显微镜的设置与延时成像方案的建立

注意： 本方法采用一台配备 sCMOS 相机、金属卤化物灯、硬件自动对焦、96 孔板载物台架和环境培养室的全自动倒置宽场显微镜实施。

1. 提前将环境培养室预热至 30 °C，以避免实验开始后自动对焦出现问题。所需时间取决于所使用的环境培养室、显微镜和加热系统。建议在实验前一晚即开始加热系统。
2. 开启显微镜及显微成像自动化与控制软件。为获得最佳信号收集效率和空间分辨率，使用高数值孔径（NA）的油浸物镜，例如 100X、1.46 NA 油镜微分干涉差（DIC）物镜。选择合适的滤光片和二向色镜，以获取微分干涉对比（DIC）图像以及黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白融合蛋白的荧光图像。
3. 在物镜上滴加一滴浸油，并在微流控芯片成像窗口的底部添加浸没液，以在图像采集过程中改善细胞对焦效果。小心地将密封的微流控装置安装到倒置显微镜的载物台上。确保芯片牢固地固定在载物台夹持器中，在整个实验过程中不会发生位移。
4. 利用嵌入式定位标记确定方向，将微流控培养室的成像窗口调至焦点。对第一个流道最左侧部分（标记为“A”）进行对焦，该区域的捕获阱尺寸为 5，对应捕获阱高度为 0.7 µm。
5. 在微流控软件中，以 4 psi 压力从入口孔 8 加载细胞持续 15 秒。通过移动载物台扫描整个成像窗口，检查培养室中的细胞密度。若未捕获到孢子，可重复细胞加载步骤，或适当增加加载压力和/或时间，直至达到理想细胞密度（每个成像窗口 1–10 个孢子，成像分辨率为 2,048 × 2,048 像素）。避免过度加载培养室。注意：我们通常使用捕获阱尺寸 5 对 Streptomyces 进行成像，但使用捕获阱尺寸 4 和 3 也获得了良好结果。
6. 在控制软件中启动流体程序，并在开始图像采集前，让微流控芯片在显微镜载物台上恒温平衡 1 小时。
7. 在显微镜控制软件中设置多维图像采集程序，以便在多个时间点对多个载物台位置进行成像：
   1. 对于自动保存：指定一个目录用于自动保存图像文件。
   2. 对于照明设置：预先确定每种特定构建体的最佳照明参数。在本实验中，使用以下曝光时间：DIC 150 毫秒，YFP 250 毫秒，RFP 100 毫秒。
   3. 对于时间序列：设置时间序列，按预定时间点顺序采集图像。为成像 S. venezuelae 的生命周期，选择在 24 小时内每隔 40 分钟采集一次图像。
   4. 对于载物台位置与自动对焦：通过移动载物台扫描培养室，并记录每个感兴趣成像位置的坐标。确保各成像位置之间保持足够距离，以最小化光漂白和光毒性。通常使用最多 12 个位置。对每个时间点运行自动对焦程序，以校正缓慢的焦平面漂移。若显微镜控制软件支持，将自动对焦策略设置为“通过硬件自动对焦进行局部表面更新”。在确认所选载物台位置的 Z 坐标后，启用硬件自动对焦。
8. 在显微镜控制软件中启动延时成像实验。
9. 在后续时间点检查所有载物台位置是否仍保持对焦。对于持续数小时的延时成像实验，即使使用自动对焦，偶尔仍会观察到载物台漂移。若需要重新对焦，应在合适的时间点暂停实验，调整焦距后，在预设的成像时间间隔内重新启动实验。
10. 在 24–30 小时后，或当目标区域的菌丝已分化为孢子时，停止图像采集。随后，在软件中停止流体程序，并拆卸微流控装置。
11. 为使用过的微流控芯片准备短期储存。将孔 1 至孔 6 中残留的培养基移除，清空废液孔 7 和细胞加载孔 8。在无菌条件下，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重新填充通道“A”中已使用的孔以及未使用的通道（“B”至“D”）中的所有孔。用封口膜密封芯片以防止干燥，并在 4 °C 下保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B04A 细菌细胞用 CellAsic ONIX 微流控培养板	Merck-Millipore	B04A-03-5PK	微流控培养板
CellAsic ONIX 微流控灌注系统及 ONIX FG（版本 5.0.2）	Merck-Millipore	EV-262	最新版 ONIX（2015 年 7 月）及程序使用说明请见：http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 显微镜	Zeiss	431007-9902-000	全自动电动倒置宽场显微镜
带温度模块 S1 和加热单元 XL S2 的 Incubator XL multi S1	Zeiss	411857-9061-000	包裹显微镜的环境培养室
Plan-Apochromat 100x/1.46 油镜 DIC 物镜	Zeiss	420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2	Hamamatsu Photonics K.K.	C11440-22CU
Illuminator HXP 120V	Zeiss	423013-9010-000
FL 滤光片组 46 HE YFP 无漂移	Zeiss	489046-9901-000	荧光滤光片组，激发光 500/25 nm，发射光 535/30 nm
FL 滤光片组 63 HE RFP 无漂移	Zeiss	489063-0000-000	荧光滤光片组，激发光 572/25 nm，发射光 629/30 nm
多孔板用 K-M 型安装支架	Zeiss	000000-1272-644	微流控板载物台固定架
ZEN pro 2012	Zeiss	410135-1002-120	显微镜控制软件
ZEN 模块 Time Lapse	Zeiss	410136-1031-110	用于设置延时显微成像实验的软件模块
ZEN 模块 Tiles/Positions	Zeiss	410136-1025-110	用于保存特定载物台位置（xzy）的软件模块
Fiji	开源软件包	http://fiji.sc/Fiji	生成延时成像视频
PBS（磷酸盐缓冲液）	Sigma	P4417-100TAB	用于填充 B04A 板中未使用通道的入口孔，以便短期储存前准备板
SV60	John Innes Centre 菌种保藏中心		S. venezuelae 菌株，表达 divIVA-mcherry 和 ftsZ-ypet