荧光延时成像观察Streptomyces venezuelae的生活周期

摘要

来源：Schlimpert, S. 等。利用微流控装置对S. venezuelae完整生命周期进行荧光延时成像。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了利用微流控装置对细菌Streptomyces venezuelae的完整生命周期进行荧光延时成像，实时观察其萌发、菌丝生长和孢子形成过程。

方案

1. 显微镜的设置与延时成像方案的建立

注意： 本方法采用一台配备 sCMOS 相机、金属卤化物灯、硬件自动对焦、96 孔板载物台架和环境培养室的全自动倒置宽场显微镜实施。

1. 提前将环境培养室预热至 30 °C，以避免实验开始后自动对焦出现问题。所需时间取决于所使用的环境培养室、显微镜和加热系统。建议在实验前一晚即开始加热系统。
2. 开启显微镜及显微成像自动化与控制软件。为获得最佳信号收集效率和空间分辨率，使用高数值孔径（NA）的油浸物镜，例如 100X、1.46 NA 油镜微分干涉差（DIC）物镜。选择合适的滤光片和二向色镜，以获取微分干涉对比（DIC）图像以及黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白融合蛋白的荧光图像。
3. 在物镜上滴加一滴浸油，并在微流控芯片成像窗口的底部添加浸没液，以在图像采集过程中改善细胞对焦效果。小心地将密封的微流控装置安装到倒置显微镜的载物台上。确保芯片牢固地固定在载物台夹持器中，在整个实验过程中不会发生位移。
4. 利用嵌入式定位标记确定方向，将微流控培养室的成像窗口调至焦点。对第一个流道最左侧部分（标记为“A”）进行对焦，该区域的捕获阱尺寸为 5，对应捕获阱高度为 0.7 µm。
5. 在微流控软件中，以 4 psi 压力从入口孔 8 加载细胞持续 15 秒。通过移动载物台扫描整个成像窗口，检查培养室中的细胞密度。若未捕获到孢子，可重复细胞加载步骤，或适当增加加载压力和/或时间，直至达到理想细胞密度（每个成像窗....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B04A 细菌细胞用 CellAsic ONIX 微流控培养板	Merck-Millipore	B04A-03-5PK	微流控培养板
CellAsic ONIX 微流控灌注系统及 ONIX FG（版本 5.0.2）	Merck-Millipore	EV-262	最新版 ONIX（2015 年 7 月）及程序使用说明请见：http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 显微镜	Zeiss	431007-9902-000	全自动电动倒置宽场显微镜
带温度模块 S1 和加热单元 XL S2 的 Incubator XL multi S1	Zeiss	411857-9061-000	包裹显微镜的环境培养室
Plan-Apochromat 100x/1.46 油镜 DIC 物镜	Zeiss	420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2	Hamamatsu Photonics K.K.	C11440-22CU
Illuminator HXP 120V	Zeiss	423013-9010-000
FL 滤光片组 46 HE YFP 无漂移	Zeiss	489046-9901-000	荧光滤光片组，激发光 500/25 nm，发射光 535/30 nm
FL 滤光片组 63 HE RFP 无漂移	Zeiss	489063-0000-000	荧光滤光片组，激发光 572/25 nm，发射光 629/30 nm
多孔板用 K-M 型安装支架	Zeiss	000000-1272-644	微流控板载物台固定架
ZEN pro 2012	Zeiss	410135-1002-120	显微镜控制软件
ZEN 模块 Time Lapse	Zeiss	410136-1031-110	用于设置延时显微成像实验的软件模块
ZEN 模块 Tiles/Positions	Zeiss	410136-1025-110	用于保存特定载物台位置（xzy）的软件模块
Fiji	开源软件包	http://fiji.sc/Fiji	生成延时成像视频
PBS（磷酸盐缓冲液）	Sigma	P4417-100TAB	用于填充 B04A 板中未使用通道的入口孔，以便短期储存前准备板
SV60	John Innes Centre 菌种保藏中心		S. venezuelae 菌株，表达 divIVA-mcherry 和 ftsZ-ypet