Pseudomonas aeruginosa 在抗生素胁迫下的群集行为

摘要

来源：Bru, J., et al., 细菌群落运动与集体应激反应的延时成像。 J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了分析细菌群集运动行为的实验步骤 铜绿假单胞菌 通过使用琼脂平板装置和延时成像技术，观察细菌从中心培养物向含有相同培养物与抗生素混合液的卫星点扩散生长的情况。

方案

1. 生长 P. aeruginosa 以及铺板条件

1. 加入10 g LB-Miller粉末至400 mL ddH₂O中，配制400 mL的LB培养基₂O. 添加额外的 8 g 琼脂以制备 2% LB-琼脂培养皿。高压灭菌以达到无菌。
2. 将20 mL熔融的LB琼脂培养基倒入直径10 cm的培养皿中，室温下静置过夜使其凝固。液体培养基于室温保存，琼脂平板则保存于4 °C。
3. 划线 P. aeruginosa 从-80 °C保存的冻存菌种中，使用无菌接种环或无菌木签在LB-琼脂培养皿上划线接种。将培养皿倒置于37 °C培养过夜。LB-琼脂平板可置于4 °C保存，最长不超过1周。
4. 用无菌接种环或无菌木签从培养皿中挑取单个菌落，接种至2 mL LB培养基中，于37 °C、100 rpm的摇床中过夜（16–18 h）培养至饱和。
5. 使用P20移液器从步骤1.4中吸取5 µL过夜培养物，将移液器枪头以10–45°的角度接近蜂拥琼脂平板的点样区域上方2.5 cm处，按至第一档完成加样，仅使液滴接触琼脂表面图1B).
   1. 避免用移液器枪头接触琼脂，以免损坏琼脂表面。使用模板确保在不同群游琼脂平板上点样的位置一致。
6. 抗生素处理时，混合30 µL过夜培养物 P. aeruginosa 加入6 µL 3 mg/mL的庆大霉素、10 µL 100 mg/mL的卡那霉素或7.5 µL 100 mg/mL的磷霉素，立即进入下一步。
   1. 移液6 µL经抗生素处理的 P. aeruginosa 使用P20移液器，以10至45°的角度将枪头移至距离点样区域上方2.5 cm处，在直径为2.8 cm的同心圆上围绕培养皿中心等距点6个卫星位置，移液时按至第一档，仅让液滴接触琼脂表面（图1D).
   2. 避免用移液器枪头接触琼脂，以免造成损伤。使用涂布模板以确保一致性。
7. 用黑色培养皿盖替换透明培养皿盖（图 2A).
8. 将群集琼脂平板放置于设置为37 °C、配有10 L水浴以维持75%湿度的培养箱内的扫描仪上（图1E, 图2B).注意： 不要触碰运动琼脂平板上出现的斑点状细胞。始终保持平板正面朝上。

结果

图1：示意图 P. aeruginosa 群集运动实验与集体应激反应 (A) P. aeruginosa 细胞在过夜培养（16–18 小时）至 OD₆₀₀ 在37 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Bacto agar, 脱水	BD Difco	214010	用于 LB-琼脂平板和群集运动琼脂平板
酪蛋白氨基酸	BD Difco	223050	用于群集运动培养基
D-葡萄糖	Fisher Chemical	D16500	右旋糖。用于群集运动培养基
磷霉素二钠盐	Tokyo Chemical Industry	F0889	储存液浓度：200 mg / mL。溶于 ddH₂O
庆大霉素硫酸盐	Sigma-Aldrich	G1914	储存液浓度：3 mg / mL。溶于 ddH₂O
卡那霉素硫酸盐	Sigma-Aldrich	60615	储存液浓度：100 mg / mL。溶于 ddH₂O
LB-Miller	BD Difco	244620	用于LB液体培养基和LB-琼脂平板
七水合硫酸镁	Sigma-Aldrich	230391	用于群集运动培养基
菌株
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn 实验室	AFS27E.118	PA14 菌株
耗材
氧化铝砂纸	3M	150 细粒度	用于黑色瓶盖处理
黑色织物	Joann	PRD7089	黑色织物
黑色喷漆	Krylon	5592 哑光黑	用于黑色瓶盖
锥形瓶	Kimax	26500	250 mL
玻璃储存瓶	Pyrex	13951L	250 mL、500 mL、1000 mL
8 英寸扎带	Gardner Bender	E173770	用于固定哑光黑色织物
培养皿（100 mm × 15 mm）	Fisher	FB0875712	100 × 15 mm 聚苯乙烯培养皿
木棒	Fisher	23-400-102	用于划线和接种细菌
设备
高压灭菌器	Market Forge Industries	STM-E	用于试剂灭菌
25 mL 移液管	USA Scientific, Inc.	1072-5410	用于移取 20 mL 配制群集运动琼脂平板
除湿机	Frigidaire	FAD704DWD 70品脱	用于维持室内相对湿度约 45%
培养箱	VWR	89032-092	用于在 37 °C 下培养细菌
Isotemp 水浴锅	Fisher	15-462-21Q	用于将培养基冷却至 55 °C
层流罩	The Baker Company	SG603A	用于平板干燥
P-20 移液器	Gilson	F123601	用于在群集运动琼脂平板上点样
移液控制器	BrandTech	accu-jet	用于移取 20 mL 配制群集运动琼脂平板