成像与定量分析抗生素胁迫下群体迁移的避让反应 铜绿假单胞菌

摘要

来源：Bru, J., 等. 细菌群游与集体应激反应的延时成像. J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了如何利用群集琼脂平板实验对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的群集回避行为进行可视化观察与测量。视频展示了在受控条件下进行延时成像的设置，并解释了抗生素诱导的应激信号如何改变细菌的运动方向，该过程通过图像分析进行量化。

方案

1. 使用扫描仪进行图像采集

1. 通过在平板式文档扫描仪上方 40–60 cm 处的支架上安装黑色哑光布料，降低培养皿周围的环境光照。使用扎带固定（图 1B）。
2. 将使用扫描软件和自动脚本软件控制扫描仪。
   1. 在扫描软件中，选择 家庭模式（图 2A）。在 图像类型 下选择 彩色 以进行彩色图像采集。为设置图像质量，在 目标位置 下选择 其他，并将 分辨率 调整为 300 dpi。在 目标尺寸 中选择 原始尺寸 以保持图像的标准大小。在 图像调整 下的所有选项均保持未勾选状态，以确保标准图像质量。注意： 目标尺寸默认设置为原始尺寸。如需选择其他目标尺寸选项，需先点击 预览。
3. 通过点击“扫描至”右侧的文件夹图标，打开文件保存设置，以设置图像的保存路径（图 2A）。
   1. 在 位置 下选择 其他，然后点击 浏览，选择用于保存图像的文件夹。
   2. 在 前缀 文本框中为图像命名。将 起始编号 设为 001，以开始图像的命名序列。在 图像格式 的 类型 中选择 JPEG (*.jpg)，将文件格式设为 JPEG，并点击 选项 以调整 详细信息。将 压缩级别 调整为 16，编码 设为标准，并勾选 嵌入 ICC 配置文件。点击 确定 关闭窗口（图 2B）。
   3. 取消勾选第一个选项（“覆盖同名文件”），并勾选接下来的三个选项（“下次扫描前显示此对话框”、“扫描后打开图像文件夹”和“扫描后显示添加页面对话框”）。点击 确定 关闭窗口。
   4. 点击 预览 检查图像质量。预览窗口将出现，且 扫描 图标变为可操作状态（图 2C）。
4. 使用脚本软件自动进行图像采集。所提供的脚本将在每 30 分钟点击扫描窗口中的“扫描”按钮以及文件保存设置窗口中的“确定”按钮。
   1. 通过点击 任务 | 导入 导入脚本，并选择 Single_scan.tsk 和 Idle_scanning.tsk。参见 图 2D。注意： Single_scan.tsk 会点击扫描窗口中的 扫描 按钮和文件保存设置窗口中的 确定 按钮。Idle_scanning.tsk 每 30 分钟激活一次 Single_scan.tsk。用户可通过修改 Idle_scanning.tsk 的激活频率来更改扫描间隔。
   2. 通过同时选中 Idle scanning (imported) 和 Single scan (imported)，右键点击 Idle scanning (imported)，然后左键点击 启用，以启用每 30 分钟一次的自动扫描（图 2D）。

注意：自动扫描将持续运行，直到用户手动停止脚本。要停止脚本，请选择 Idle scanning (imported)，右键单击 Idle scanning (imported)，然后左键单击 Enabled，勾选标记将被移除。

2. 编译延时图像并测量群集排斥行为

1. 使用 ImageJ 进行视频编辑和图像分析。
2. 通过点击 文件 | 导入 | 图像序列 并选择图像，将所有扫描图像导入 ImageJ。在 序列选项 窗口中，勾选 转换为 RGB 以保持图像为彩色。图像数量 表示所选图像的数量。
3. 将 起始图像 保持为 1，以从文件夹中的第一张图像开始；将 缩放图像 设置为 100%，以保留图像的原始尺寸。不要勾选 使用虚拟堆栈。点击 确定 并等待图像加载（图 3A）。
4. 通过点击 编辑 | 选项 | 输入/输出…，将视频压缩级别设置为 100，并将 JPEG 质量 调整为 100。
5. 通过点击 文件 | 另存为 | AVI 将文件保存为 .avi 格式。将 压缩 调整为 JPEG，将 帧率 调整为 5 fps（图 3B）。将该延时 .avi 文件保存至目标文件夹。
6. 为量化群集排斥距离，在 ImageJ 中打开群集运动末期的一幅图像。点击 文件 | 打开 并选择图像。通过点击 分析 | 设置比例尺 进行比例调整：将 像素距离 设置为 118，已知距离 设置为 1，像素纵横比 设置为 1.0，长度单位 设置为 cm（图 3C）。不要勾选 全局。点击 确定 关闭窗口。
7. 点击 直线图标，从卫星位置处菌落的中心测量至群集种群边缘的距离。选择 分析 | 测量，将弹出一个显示测量结果（长度）的新窗口（图 3D）。注意：使用 "+" 放大，使用 "-" 缩小。

结果

图1：培养箱内扫描仪的设置。 （A）黑色培养皿盖。这些皿盖在扫描过程中用于减少光线反射，替代透明的培养皿盖。（B）平板式文档扫描仪放置于设定为37 °C的培养箱中。六个带有黑色皿盖的培养皿放置在扫描仪上（左图）。在扫描仪上方60 cm处的支架上固定有黑色哑光织...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Bacto agar, 脱水	BD Difco	214010	用于 LB-agar 平板和群集运动 agar 平板
酪蛋白氨基酸	BD Difco	223050	用于群集运动培养基
D-葡萄糖	Fisher Chemical	D16500	右旋糖。用于群集运动培养基
七水合硫酸镁	Sigma-Aldrich	230391	用于群集运动培养基
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P0662	用于 5X M8 培养基
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888	用于 5X M8 培养基
七水合磷酸氢二钠	Fisher Chemical	S373	用于 5X M8 培养基
菌株
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn 实验室	AFS27E.118	PA14 菌株
耗材
黑色喷漆	Krylon	5592 Matte Black	用于制作黑色盖子
8 英寸扎带	Gardner Bender	E173770	用于固定哑光黑色织物
培养皿（100 mm × 15 mm）	Fisher	FB0875712	100 × 15 mm 聚苯乙烯培养皿
设备
ImageJ	NIH	v1.52a	图像分析软件
培养箱	VWR	89032-092	用于在 37 °C 下培养细菌
扫描仪	Epson	Epson Perfection V370 Photo	用于平板成像的扫描仪
扫描仪自动化软件	RoboTask Lite	v7.0.1.932	用于每 30 分钟成像
扫描仪图像采集软件	Epson	v9.9.2.5US	用于平板成像的软件