诱导 Vibrio parahaemolyticus 分化为游动细胞

摘要

来源： Heering, J., 等细胞分化诱导与单细胞成像 副溶血性弧菌 游动细胞与群集细胞 视频实验杂志 (2017)

本视频展示了利用特殊制备的琼脂培养基诱导副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）产生游走细胞分化的实验方法。通过调控环境信号，如铁离子耗竭、钙离子添加以及表面接触，可刺激细菌从游动态转变为具有侧生鞭毛的伸长型游走细胞。这些分化后的细胞在固体表面扩散，形成特征性的游走焰状菌落，标志着形态转变的成功发生。

方案

1. 诱导游动细胞分化

注意：以下步骤描述了如何诱导副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）分化为其游走细胞生命周期，以及如何在固体表面刺激其增殖。

1. 在100 mL ddH₂O中悬浮4 g心浸出液（HI）琼脂，以制备泳动平板。

2. 在微波炉中小心煮沸 HI 琼脂溶液，并不时摇动瓶子，直至粉末完全溶解。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。

3. 高压灭菌后，将HI琼脂冷却至60–65 °C。加入2,2´-联吡啶，使其终浓度为50 µM（用100%乙醇配制的50 mM储备液）。加入CaCl₂，使其终浓度为4 mM（用ddH₂O配制的4 M储备液）。如有必要，可向溶液中加入抗生素以维持质粒。

注意：如果计划使用诱导型质粒，需加入诱导剂至其最终浓度。

注意：2,2´-联吡啶：具有急性毒性（经口、经皮、吸入）。操作该化学品时需佩戴手套和安全护目镜。

4. 将 30 - 35 mL 最终的 HI 琼脂溶液倒入一个圆形 150 mm 的培养皿中，静置使琼脂凝固。

5. 在点样细胞培养物之前，将琼脂平板置于37 °C下干燥至少10分钟（或直至液体残留物完全消失，但不可过久），平板需直立放置且皿盖打开。
注意：干燥时间很大程度上取决于所使用的培养箱，过度干燥的平板将无法支持副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）的群集运动。（此步骤非常重要！）平板必须新鲜使用，存放时间不应超过2 - 3小时。陈旧的平板会过于干燥，无法诱导群集运动。

6. 从单个菌落边缘接种少量细胞至5 mL LB（Luria-Bertani）液体培养基中。在37 °C条件下振荡培养，直至OD₆₀₀达到0.8，通常需要约2–3小时。此后，菌液即可用于点种到HI群游琼脂平板上。

7. 在 HI 琼脂群集运动平板的中心点加 1 µL 细胞培养物（图 1A）。

8. 让斑点自然晾干（图1B）。

9. 用透明塑料胶带密封培养板，并确保其牢固粘附，否则在过夜孵育过程中可能会脱落（图1C）。

注意：确保密封完全至关重要。贴膜时应避免产生气泡和褶皱。

10. 将平板在 24 °C 下孵育过夜。这将导致形成具有从群集菌落边缘向外延伸的群集光晕的 V. parahaemolyticus 群集菌落（图 2）。

结果

图1：游动子细胞分化诱导及显微镜成像用细胞的制备。 产生副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）游动子细胞并制备显微镜载玻片以进行单个游动子细胞显微观察的工作流程简化示意图。（A）取1 µL OD₆₀₀ = 0.8的副溶血性弧菌（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基成分
LB培养基	Roth	X968.3
Difco 琼脂，颗粒状	BD	214510	用于制备含LB培养基的LB琼脂
Difco 心脑浸出液琼脂	BD	244400	用于制备HI琼脂群游平板
Agarose NEEO，超纯级	Roth	2267.3	用于制备显微镜用琼脂糖垫
添加剂
2,2'-联吡啶	Sigma Aldrich	D216305-25G	用于制备HI琼脂群游平板
氯化钙二水合物	Roth	5239.1	用于制备HI琼脂群游平板
硬件设备
带卡扣的培养皿（150 mm × 20 mm）	Sarstedt	82.1184.500	用于制备HI琼脂群游平板
kelvitron t (B 6420)	Heraeus	-	用于干燥HI琼脂群游平板