监测植物细胞中的细菌感染与效应蛋白递送

摘要

来源：Lee, H. et. al., 利用分裂绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种利用分裂型超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）互补结合共聚焦显微镜技术，在植物细胞中监测细菌感染及效应蛋白递送的方法。该方法可实现对效应蛋白转入宿主细胞胞质过程的精确定位与可视化。

方案

注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。

1. 植物材料的准备（4 周）

1. 准备工作 Nicotiana benthamiana 植物
   1. 播种2粒种子 N. benthamiana 在每个花盆的土壤表面覆盖塑料罩，然后将托盘置于25 °C、60%湿度、16小时光照/8小时黑暗光周期的培养室中，使种子萌发。
   2. 两周后，从每个花盆中挑选并剔除最小的幼苗。继续在步骤1.1.1中用于萌发的相同生长条件下培养植株。每两天向每个托盘添加1升水。
      注意： 不同实验室的植物培养条件可能有所差异。因此，请遵循常规浇水方案，以确保植物健康生长。
   3. 一周后，将植株转移至新托盘中，并留出充足空间以利于进一步生长。在步骤1.1.1所述条件下继续培养植株，直至其生长至4周龄，准备进行浸润处理。
      注意： 植物的生长可能因不同实验室的培养条件而有所差异。通常，我们发现4周龄的 N. benthamiana 植株长出约六片叶子。
2. 准备 拟南芥 转基因植物
   1. 请参阅 材料表 并订购转基因品系 拟南芥 种子。
   2. 浸泡约50 - 100个转基因 拟南芥 将种子置于1 mL蒸馏水中，在4 °C黑暗条件下保存3天，以同步萌发起始时间。
   3. 在穴盘的土壤表面播种约2-3粒种子，并用塑料罩盖住穴盘。将种子置于23 °C、60%湿度、10/14小时光/暗光周期条件下萌发。
      注意： 种子应为纯合子。然而，建议重新确认该批次中转基因的存在。在此情况下，先用70%乙醇洗涤种子2分钟，再用含0.05% Triton X-100的50%次氯酸钠溶液（约2%次氯酸盐）处理5分钟进行表面灭菌，随后用无菌双蒸水（ddH₂O）清洗5–6次。₂O）。灭菌后，在4 °C下层积处理3天，然后将种子接种于含有25 µg/L潮霉素B的植物萌发培养基上，以筛选转基因植株。
   4. 一周后，每穴仅保留一株植物，并在与步骤1.2.3相同的生长条件下继续培养植物。
      注意： 四周龄的植株用于实验 Pseudomonas syringae 感染。每隔一天浇水一次，以保持植物健康。

2. 准备 假单胞菌属 培养（约1周）

1. 构建用于Pseudomonas转化的质粒
   1. 参考材料表，订购基于III型分泌系统（T3SS）效应子递送系统的相应载体。
   2. 使用位点特异性重组克隆技术将目标效应子基因插入效应子递送载体。
      注意：在监测全长效应子蛋白亚细胞定位时，应将全长基因插入pBK-GW-1-2或pBG-GW-1-2中。也可选择含有2x sfGFP11（sfGFP的第11个β链）的pBK-GW-1-4或pBG-GW-1-4，以增强荧光信号。对于缺乏信号肽的部分效应子，应使用pBK-GW-2-2或pBK-GW-2-4。
2. 通过标准电穿孔法，将携带与sfGFP11标签融合的效应子的质粒转化至番茄丁香假单胞菌（P. syringae pv. Tomato）CUCPB5500（Pst）中。
   注意：如有需要，也可使用其他Pseudomonas菌株。sfGFP11标签系统适用于多种载体，效应子基因的表达由AvrRpm1启动子调控，该系统在例如荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens，EthAn）中同样适用。
3. 将转化后的细菌细胞均匀涂布于含有100 µg/mL利福平和25 µg/mL卡那霉素或25 µg/mL庆大霉素的King’s B琼脂平板上，在28 °C培养2天。
4. 挑取单菌落接种至含相应抗生素的King’s B液体培养基中，于28 °C、200 rpm振荡培养过夜。
5. 制备甘油菌种。加入经高压灭菌的甘油至终浓度为50%，于-80 °C保存。

3. 细胞器靶向sfGFP1-10的瞬时表达^OPT (1- 10^th sfGFP 的 β-链）在 N. benthamiana （4 天）

1. 制备 农杆菌 培养
   1. 订购所需的细胞器靶向 sfGFP1-10 载体^OPT 质粒（参见 材料列表).
   2. 将质粒转化至 Agrobacterium tumefaciens 用GV3101菌株转化细胞。在添加50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL利福平的LB（Luria-Bertani）琼脂培养基中，于28 °C培养2天。
   3. 从LB琼脂平板上的单个菌落中挑取菌体，接种至5 mL含有50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL利福平的液体LB培养基中。在28 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
   4. 3,000 × g 离心 10 分钟收集细胞。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 新鲜配制的渗透缓冲液中。
   5. 测量数量 农杆菌 通过在600 nm吸收波长（Abs 600 nm）下测定光密度（OD）值来调整OD₆₀₀ 用浸润缓冲液将细菌浓度调整至0.5。
      注意： 1 mL 悬液足以在两个位点进行浸润。
   6. 将培养物置于室温下，用慢速摇床轻柔振荡1 - 5小时，然后再进行渗透处理。
   7. 用10 µL枪头在待浸润的叶片中心刺一个小孔，然后使用1 mL无针注射器进行浸润 农杆菌 悬浮液。用注射器将约500 µL由步骤3.1.5制备的悬浮液小心且缓慢地注入叶片的近轴面。每组实验至少在三株不同的植株上重复 infiltration 操作。
      注意： 出于健康和安全考虑，渗透过程中应佩戴眼部防护装备。
   8. 擦去叶片上残留的细菌悬浮液，并标记浸润区域的边界。
   9. 将浸润后的植株置于与步骤1.1.1相同的生长条件下培养2天。

4. 接种 假单胞菌 （4 天）

1. 将步骤2.5中含适当抗生素的甘油菌种在King’s B琼脂培养基上划线，于28 °C培养2天，以获得转化后的Pseudomonas菌株。
   注意：Pseudomonas菌株的生长状态至关重要。若菌落生长不良，需重新划线，或在继续实验前将菌体在King’s液体培养基中增殖。
2. 用接种环取一环Pseudomonas菌体，接种至Mannitol-Glutamate（MG）液体培养基中，于28 °C、200 rpm振荡培养过夜。
3. 以3,000 x g离心10分钟收集菌体。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于10 mM MgCl₂溶液中，并将OD₆₀₀调整至0.02（1 x 10⁷ cfu/mL）用于接种N. benthamiana叶片，或调整至0.002（1 x 10⁶ cfu/mL）用于接种Arabidopsis叶片。
4. 对于N. benthamiana，将Pseudomonas菌悬液浸润至此前2天已接种携带sfGFP1-10^OPT构建体的Agrobacterium的叶片区域（如步骤3.1.7所述）。对于表达sfGFP1-10^OPT的转基因Arabidopsis，将Pseudomonas菌悬液浸润至两片4周龄、短日照条件下生长的叶片中。
   注意：实验需至少使用三株植物以满足生物学重复要求。

5. 通过共聚焦显微镜观察 sfGFP 信号（1 天）

1. 从叶片上切下叶圆片 假单胞菌接种的叶片。在渗透后的特定时间点 假单胞菌，图像两个2-cm² 使用配备40倍/1.2数值孔径（NA）C-Apochromat水浸物镜或63倍/0.8数值孔径（NA）C-Apochromat油浸物镜的激光扫描共聚焦系统，对来自单株植物的叶片圆片进行观察。为避免受机械损伤致死的细胞干扰，应观察远离浸润孔区域的细胞。
2. 从488 nm氩离子激光器的低功率设置开始观察。逐步增加激光功率以检测sfGFP。
   注意： 我们通常使用2 - 15%的激光强度来检测荧光信号。然而，激光功率和检测参数应根据用户所用显微镜系统进行调整。此处，发射滤光片设置为520 - 550 nm。死细胞在488 nm激光激发下常产生自发荧光。因此，应将未标记sfGFP11标签的相同效应子作为阴性对照，在相同观察条件下进行浸润和观察。此外，过高的激光激发会诱导叶绿素自发荧光。因此，应利用对照植物细胞调整激光强度，以避免诱导叶绿素自发荧光。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
拟南芥转基因品系			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 利用分裂荧光蛋白片段通过III型分泌系统对丁香假单胞菌效应子进行时空监测。Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
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NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
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PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
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PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
细胞器靶向sfGFP1-10OPT质粒			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 利用分裂荧光蛋白片段通过III型分泌系统对丁香假单胞菌效应子进行时空监测。Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
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基于III型分泌系统的sfGFP11标记Gateway兼容载体，用于效应子递送	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 利用分裂荧光蛋白片段通过III型分泌系统对丁香假单胞菌效应子进行时空监测。Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 µg/mL）
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 µg/mL）
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 µg/mL）
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 µg/mL）
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；抗庆大霉素（25 µg/mL）
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；抗庆大霉素（25 µg/mL）
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；抗庆大霉素（25 µg/mL）
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；抗庆大霉素（25 µg/mL）
细菌菌株
根癌农杆菌 GV3101			Csaba Koncz 和 Jeff Schell，TL-DNA 基因5的启动子控制由新型农杆菌双元载体携带的嵌合基因的组织特异性表达。Mol Gen Genet. 204, 383-396 (1986)；抗庆大霉素（50 µg/mL）和利福平（50 µg/mL）
丁香假单胞菌番茄致病变种 CUCPB5500			Kvitko, B. H. 等。丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000 III型分泌系统效应子基因库的缺失揭示了效应子之间的功能重叠。PLoS Pathog. 5 (4) (2009)；抗利福平（100 µg/mL）
培养基组分
植物萌发培养基			将2.165 g/L Murashige & Skoog粉末、10 g/L蔗糖加入水中，调节pH至5.8，加入2.2 g/L Phytagel，高压灭菌。
Murashige & Skoog培养基（含维生素）	Duchefa Biochemie	M0222	4 °C保存。
蔗糖	Duchefa Biochemie	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
LB培养基			向水中加入10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl。固体培养基需添加15 g/L微琼脂。高压灭菌。待溶液冷却至55 °C，必要时加入抗生素。
胰蛋白胨	BD Bioscience	211705
酵母提取物	BD Bioscience	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
微琼脂	Duchefa Biochemie	M1002
King's B培养基			向水中加入10 g/L蛋白胨#2、1.5 g/L无水K2HPO4、15 g/L琼脂。高压灭菌。冷却至55 °C，向培养基中加入无菌的15 mL/L甘油和5 mL/L MgSO4。必要时加入抗生素。
蛋白胨	BD Bioscience	212120
无水K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
甘油	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Bioscience	214010
甘露醇-谷氨酸（MG）液体培养基			向水中加入10 g/L甘露醇、2 g/L L-谷氨酸、0.5 g/L KH2PO4、0.2 g/L NaCl和0.2 g/L MgSO4，调节pH至7
甘露醇	Duchefa Biochemie	M0803
L-谷氨酸	Duchefa Biochemie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
侵染缓冲液			10 mM MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）、10 mM MgCl2、150 µM乙酰丁香酮。pH 5.6；使用前新鲜配制。
MES	Duchefa Biochemie	M1503	在水中配制100 mM（pH 5.6）储备液，过滤除菌。
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	在水中配制100 mM储备液，高压灭菌。
乙酰丁香酮	Sigma-Aldrich	D134406	在DMSO中配制150 mM储备液。
共聚焦显微镜设备/材料
710激光扫描共聚焦系统	Carl Zeiss
Axio observer Z1倒置显微镜	Carl Zeiss