监测植物细胞中的细菌感染与效应蛋白递送

摘要

来源：Lee, H. et. al., 利用分裂绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种利用分裂型超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）互补结合共聚焦显微镜技术，在植物细胞中监测细菌感染及效应蛋白递送的方法。该方法可实现对效应蛋白转入宿主细胞胞质过程的精确定位与可视化。

方案

注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。

1. 植物材料的准备（4 周）

1. 准备工作 Nicotiana benthamiana 植物
   1. 播种2粒种子 N. benthamiana 在每个花盆的土壤表面覆盖塑料罩，然后将托盘置于25 °C、60%湿度、16小时光照/8小时黑暗光周期的培养室中，使种子萌发。
   2. 两周后，从每个花盆中挑选并剔除最小的幼苗。继续在步骤1.1.1中用于萌发的相同生长条件下培养植株。每两天向每个托盘添加1升水。
      注意： 不同实验室的植物培养条件可能有所差异。因此，请遵循常规浇水方案，以确保植物健康生长。
   3. 一周后，将植株转移至新托盘中，并留出充足空间以利于进一步生长。在步骤1.1.1所述条件下继续培养植株，直至其生长至4周龄，准备进行浸润处理。
      注意： 植物的生长可能因不同实验室的培养条件而有所差异。通常，我们发现4周龄的 N. benthamiana 植株长出约六片叶子。
2. 准备 拟南芥 转基因植物
   1. 请参阅 材料表 并订购转基因品系 拟南芥 ....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
拟南芥转基因品系			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 利用分裂荧光蛋白片段通过III型分泌系统对丁香假单胞菌效应子进行时空监测。Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
细胞器靶向sfGFP1-10OPT质粒			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 利用分裂荧光蛋白片段通过III型分泌系统对丁香假单胞菌效应子进行时空监测。Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCherry1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CYTO-sfCFP1-10	Addgene	97405
基于III型分泌系统的sfGFP11标记Gateway兼容载体，用于效应子递送	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 利用分裂荧光蛋白片段通过III型分泌系统对丁香假单胞菌效应子进行时空监测。Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 µg/mL）
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 µg/mL）
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 µg/mL）
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；抗卡那霉素（25 µg/mL）
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；抗庆大霉素（25 µg/mL）
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；抗庆大霉素（25 µg/mL）
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t；抗庆大霉素（25 µg/mL）
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t；抗庆大霉素（25 µg/mL）
细菌菌株
根癌农杆菌 GV3101			Csaba Koncz 和 Jeff Schell，TL-DNA 基因5的启动子控制由新型农杆菌双元载体携带的嵌合基因的组织特异性表达。Mol Gen Genet. 204, 383-396 (1986)；抗庆大霉素（50 µg/mL）和利福平（50 µg/mL）
丁香假单胞菌番茄致病变种 CUCPB5500			Kvitko, B. H. 等。丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000 III型分泌系统效应子基因库的缺失揭示了效应子之间的功能重叠。PLoS Pathog. 5 (4) (2009)；抗利福平（100 µg/mL）
培养基组分
植物萌发培养基			将2.165 g/L Murashige & Skoog粉末、10 g/L蔗糖加入水中，调节pH至5.8，加入2.2 g/L Phytagel，高压灭菌。
Murashige & Skoog培养基（含维生素）	Duchefa Biochemie	M0222	4 °C保存。
蔗糖	Duchefa Biochemie	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
LB培养基			向水中加入10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl。固体培养基需添加15 g/L微琼脂。高压灭菌。待溶液冷却至55 °C，必要时加入抗生素。
胰蛋白胨	BD Bioscience	211705
酵母提取物	BD Bioscience	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
微琼脂	Duchefa Biochemie	M1002
King's B培养基			向水中加入10 g/L蛋白胨#2、1.5 g/L无水K2HPO4、15 g/L琼脂。高压灭菌。冷却至55 °C，向培养基中加入无菌的15 mL/L甘油和5 mL/L MgSO4。必要时加入抗生素。
蛋白胨	BD Bioscience	212120
无水K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
甘油	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Bioscience	214010
甘露醇-谷氨酸（MG）液体培养基			向水中加入10 g/L甘露醇、2 g/L L-谷氨酸、0.5 g/L KH2PO4、0.2 g/L NaCl和0.2 g/L MgSO4，调节pH至7
甘露醇	Duchefa Biochemie	M0803
L-谷氨酸	Duchefa Biochemie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
侵染缓冲液			10 mM MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）、10 mM MgCl2、150 µM乙酰丁香酮。pH 5.6；使用前新鲜配制。
MES	Duchefa Biochemie	M1503	在水中配制100 mM（pH 5.6）储备液，过滤除菌。
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	在水中配制100 mM储备液，高压灭菌。
乙酰丁香酮	Sigma-Aldrich	D134406	在DMSO中配制150 mM储备液。
共聚焦显微镜设备/材料
710激光扫描共聚焦系统	Carl Zeiss
Axio observer Z1倒置显微镜	Carl Zeiss