使用光图案水凝胶降解进行靶向细菌菌落分离

Abstract

资料来源： Fattahi， N. 等人。 用于细菌筛选、选择和分离的可光降解水凝胶界面。 J. Vis. Exp.（2021）。

该视频演示了使用紫外线从可光降解水凝胶中提取细菌菌落。选择特定的菌落，并设计图案化光照射以启动局部水凝胶降解。调整光强度和持续时间后，施加紫外线，释放菌落。然后通过管子吸出菌落并转移到管中进行下游分析。

Protocol

1. 细菌菌株和培养方案

1. 琼脂平板上的细菌条纹菌落，补充有适当的生长培养基。在本报告中， 枯草芽孢杆菌 （菌株1A1135，芽孢杆菌遗传种群中心）在ATGN（0.079 M KH₂PO₄ （磷酸二氢钾）、0.015 M（NH₄）₂SO₄ （硫酸铵）、0.6 mM MgSO₄·7H₂O（硫酸镁七水合物）、0.06 mM CaCl₂·2H₂O（二水氯化钙）、0.0071 mM MnSO₄·H₂O（硫酸锰（II）一水合物）、 0.125 M FeSO₄·7H₂O（硫酸亚铁七水合物），28 mM 葡萄糖，pH：7 ± 0.2,15 g/L 琼脂）琼脂平板，在补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 ATGN 琼脂平板上补充有 100 μg/mL 大观霉素和 大肠杆 菌（菌株 25922，ATCC）。
   注意：先前使用这些材料封装和释放水凝胶的报道使用根 癌曲霉 C58细胞
2. 从 ATGN 琼脂平板中挑选所需的菌落并开始过夜培养。对于此处使用的 大肠杆菌 和 枯草芽孢杆菌 菌株，在37°C下培养，同时在ATGN液体培养基中以215 rpm摇动24小时。将细胞培养物储存在-80°C的50%甘油中，直到将来使用。
3. 使用无菌接种环从甘油储备中挑选两种菌株的菌落，并在 ATGN 液体培养基中以 37°C 和 215 rpm 孵育 24 小时。

2. 水凝胶形成所需材料的制备

1. 光降解PEG-o-NB-二丙烯酸酯（聚（乙二醇）-邻硝基苄基-二丙烯酸酯）合成
   注意：PEG-o-NB-二丙烯酸酯的内部合成已得到充分描述和先前报道。或者，由于合成是常规的，因此可以从化学合成设施外包。
2. 交联缓冲液
   1. 采用细菌菌株所选培养基的配方，并制备含有 2 倍营养物质的培养基。将磷酸盐，例如 NaH₂PO₄ （磷酸二氢钠）加入培养基中，至终浓度为 100 mM。然后，使用 5 M NaOH（氢氧化钠）（水溶液）将 pH 值调节至 8。
   2. 对缓冲溶液进行灭菌并将其储存在-20°C直至进一步使用。
      注意：排除介质中存在的任何过渡金属，因为这些金属会催化硫醇氧化为二硫键。
3. PEG-o-NB-二丙烯酸酯溶液
   1. 对于每mg等分试样PEG-o-NB-二丙烯酸酯（3,400 Da分子量）粉末，加入3.08μL超纯水，以达到49mM浓度的PEG-o-NB-二丙烯酸酯（98mM丙烯酸酯浓度）。
   2. 涡旋溶液直至充分混合，并将该溶液储存在-20°C直至进一步使用。
4. 4 臂 PEG-硫醇溶液
   1. 对于 4 臂 PEG-硫醇（10,000 Da 分子量）制备，每 mg 粉末加入 4 μL 超纯水，以达到 20 mM 浓度（80 mM 硫醇浓度）。
   2. 涡旋该溶液直至充分混合，并将该溶液储存在-20°C直至进一步使用。

3. 全氟烷基化（非反应性）盖玻片的制备

1. 将最多 5 张载玻片 （25 mm x 75 mm x 1 mm） 放入聚丙烯载玻片邮寄器内。用2%（w / v）洗涤剂溶液（材料表）对载玻片进行超声处理20分钟。
2. 用超纯水冲洗载玻片三次，然后在水中超声处理载玻片20分钟。使用 N₂ （氮气）流干燥载玻片。
3. 根据第 4.1 节中的方案，在载玻片两侧进行等离子清洁（参见 材料表）2 分钟。
4. 将等离子体清洁的载玻片放回载玻片邮寄器中，并用甲苯中的三氯（1H，1H，2H，2H，2H，-全氟辛基）硅烷的0.5%（v / v）溶液填充容器。让这些载玻片在室温（RT）下功能化3小时。
5. 载玻片功能化后，在载玻片邮件机内冲洗载玻片，首先用甲苯，然后用乙醇（每种溶剂冲洗三次）。接下来，用N₂的流干燥每个功能化载玻片。

4. 硫醇官能化（基础）盖玻片的制备

1. 使用等离子清洗剂清洁玻璃盖玻片
   1. 将 18 mm x 18 mm 的盖玻片放入培养皿中。然后，将培养皿放入等离子清洗器室中，并打开等离子清洗器的电源。
   2. 打开真空泵以清除腔室内的空气，直到压力表读数为 400 mTorr。
   3. 打开计量阀，让空气进入腔室，直到压力表达到稳定压力 （800-1000 mTorr）。然后，选择具有“Hi”模式的 RF 并暴露盖玻片 3 分钟。
   4. 3 分钟后，关闭射频模式和真空泵。
   5. 将培养皿从腔室中取出，翻转盖玻片，将它们放回腔室中与等离子体接触，然后露出玻璃盖玻片的另一面。
   6. 重复步骤 4.1.2-4.1.4 用等离子清洁玻璃盖玻片未处理的一面。
   7. 完成该过程后，从培养皿中取出培养皿并关闭等离子清洗器和真空泵。
2. 用食人鱼溶液清洁和羟基化盖玻片
   注意：标准食人鱼清洁方案可用于清洁和羟基化玻璃玻片。食人鱼溶液是 H₂O₂ （过氧化氢）和 H₂SO₄ （硫酸）的 30：70 （v/v） 混合物。也可以使用清洁玻璃盖玻片的替代方法。
   注意： 食人鱼溶液对有机溶剂具有强烈的腐蚀性和爆炸性，应格外小心处理。应实施适当的安全和遏制措施，例如使用适当的个人防护设备（实验室外套、耐化学腐蚀围裙、安全眼镜、面罩、耐酸丁基手套）。所有与食人鱼溶液接触的玻璃器皿和工作表面在使用前都应清洁、干燥且无有机残留物。食人鱼溶液切勿储存在部分密闭或密闭的容器中。
   1. 将干净的 100 mm x 50 mm 玻璃培养皿放在通风橱下的搅拌速度可调的电炉磁力搅拌器上，然后向培养皿中加入 14 mL H₂SO₄ 。
   2. 使用聚四氟乙烯涂层的镊子轻轻地将一个小型的聚四氟乙烯涂层磁力搅拌棒放入培养皿内。然后，慢慢转动搅拌器，以免酸溅出。
   3. 接下来，轻轻地将 6 mL H₂O_{2 添加到} 培养皿中，让溶液充分混合。
   4. 关闭搅拌器，然后使用镊子从盘子上取下搅拌棒。接下来，使用镊子轻轻地将盖玻片放入培养皿内，并将温度设置为 60-80 °C。
   5. 30分钟后，使用镊子轻轻取下盖玻片，并将其浸入去离子水（DI）水中两次，以洗掉残留的食人鱼溶液。
   6. 用水冲洗后，将盖玻片储存在室温去离子水中直至进一步使用。
   7. 关闭电炉，让食人鱼溶液冷却。
   8. 要处理食人鱼溶液，请将装有冷却食人鱼溶液的 100 mm x 50 mm 玻璃皿轻轻放入体积至少为 1.5 L 的更大空玻璃烧杯中。然后加入1L水稀释，加入碳酸氢钠粉中和。注意碳酸氢钠会引起起泡和发热，应非常缓慢地添加;否则，冒泡可能会导致酸飞溅。当进一步添加碳酸氢钠不引起起泡时，用pH试纸检查pH值以验证其是否已被中和。一旦溶液被中和并冷却，就可以将其倒入水槽中。
3. 盖玻片的硫醇功能化
   1. 在干甲苯中制备 269 mM （3-巯基丙基）三甲氧基硅烷 （MPTS） 溶液的 5% （v/v） 溶液。
   2. 将 10 mL 溶液加入单个 50 mL 锥形离心管中。在每个管中放入一个清洁过的盖玻片，并将其浸入溶液中。
      注意：每50mL试管一个盖玻片用于确保底物两侧的硫醇化而不受其他底物的干扰。
   3. 4小时后，用甲苯，1：1（v / v）乙醇：甲苯混合物和乙醇洗涤每个盖玻片（每个盖玻片洗涤四次）。
      注意：这是通过将每个盖玻片依次浸入含有上述溶液的锥形离心管中来完成的。
   4. 冲洗底物后，将其浸入乙醇中并储存在4°C直至进一步使用。
      注意：根据盖玻片的数量，由于一次处理一个盖玻片，这种方法可能会变得费力。对于多个盖玻片，可以使用同时安装多个盖玻片的哥伦比亚罐。

5. 硅微孔阵列的制造

1. 聚对二甲苯涂层：使用先前研究文章中描述的标准方案用聚对二甲苯涂覆硅片。
2. 微加工：按照Barua等人描述的方案来设计和制造微孔阵列。​

6. 水凝胶形成

1. 在玻璃盖玻片上形成块状水凝胶
   1. 水凝胶前体溶液：将 12.5 μL 交联缓冲液加入 0.5 mL 微量离心管中，然后加入 5.6 μL PEG-o-NB-二丙烯酸酯溶液。最后，向混合物中加入 6.9 μL 4 臂 PEG-硫醇溶液。
      注意：将 4 臂 PEG 硫醇添加到混合物中引发交联反应。因此，水凝胶前体溶液应在混合后立即使用。
   2. 对于在水凝胶前体溶液中封装细胞，请按照步骤 6.1.3-6.1.9 进行作。
   3. 对于细胞封装，在步骤 6.1.1 之前，用所需的细胞密度接种交联缓冲液。如前所述19，观察到交联缓冲液中7.26×10⁷ CFU/mL的细胞密度与封装在水凝胶上的~90个细胞/mm² 的密度相关。
   4. 将硫醇化基盖玻片放在干净的培养皿上。在盖玻片的相对两侧放置两个垫片（参见 材料表）。
      注意：盖玻片的硫醇功能化对于水凝胶与盖玻片表面的共价附着是必要的。这是通过表面的硫醇基团和水凝胶前体溶液中存在的丙烯酸酯基团的反应来完成的。
   5. 通过将垫片粘在培养皿上，将垫片固定在底座盖玻片上。
   6. 在非反应性全氟烷基化载玻片上移液所需体积的前体溶液。
   7. 将全氟烷基化载玻片放在基础盖玻片上（图1C）。在室温下等待 25 分钟，使水凝胶形成完成。
   8. 凝胶化后，轻轻取出全氟烷基化载玻片。水凝胶将保持附着在基础盖玻片上。​
      注意：对于 18 mm x 8 mm 盖玻片以获得 12.7 μm 厚的膜，请使用 ~7 μL 前体溶液（图 1A、B）。使用更多体积的前体溶液可能会导致在基础盖玻片下方形成水凝胶。这可能会导致底座盖玻片粘在培养皿上并在尝试移除时破裂。此外，盖玻片下方的水凝胶残留物对于显微镜检查来说是有问题的。需要温和地去除非反应性全氟烷基化载玻片，因为快速去除会损坏水凝胶。
   9. 将底物置于指定培养基中的 60 mm x 15 mm 培养皿中。在这里，在37°C下，使用补充100μg/mL大观霉素（用于 枯草芽孢杆菌 ）或100μg/mL氨苄青霉素（用于大 肠杆菌 ）的ATGN培养基进行24小时培养时间。

7. 细胞提取材料准备

1. PDMS（聚二甲基硅氧烷）支架制备
   1. 将一叠十个 18 x 18 毫米的盖玻片粘在一起，然后将这叠盖玻片粘在培养皿的底部。
   2. 要制造PDMS支架，请在塑料杯中以10：1的体积比混合PDMS前驱体和固化剂，在真空干燥器中对混合物进行脱气，然后将混合物倒入培养皿中。
   3. 在80°C下固化PDMS90分钟。然后，在胶带块周围切割以取下 PDMS 支架，并将 PDMS 支架放在载玻片上，以便于显微镜检查。
2. 微量注射器和管路制备
   1. 切割 20 cm 的 PTFE（聚四氟乙烯）管（内径 0.05 英寸），并将管的一端连接到 100 μL 微升注射器上。
      注意：对于提取，请避免使用移液器，因为通过移液器吸头绘制释放的细胞会损坏水凝胶表面并导致污染。

8. 使用图案照明工具降解水凝胶

1. 打开显微镜（参见 材料表）。然后，打开图案照明工具（请参阅 材料表）。
2. 打开 365 nm LED 光源模拟和数字控制模块。接下来，打开LED光源控制模块。
3. 打开显微镜软件和图案照明工具的软件。打开硬件配置窗口后，选择“加载”按钮。
   注意：此处将加载三个设备。（第三方相机、控制模块和图案照明工具）
4. 按开始按钮。现在将打开光图案化软件窗口。选择第一个选项，即窗口左侧边栏上的“设备控制”按钮。
5. 校准图案化照明工具。
   注意：校准必须使用与用于光照相同的显微镜物镜和滤光片进行。
   1. 将显微镜物镜设置为 10 倍放大倍率。
      注意：这种放大倍率允许显微镜透镜和样品表面之间有足够的工作距离。它还允许通过图像窗口实时监控和记录检索过程。
   2. 将显微镜镜头和滤光片设置为用于曝光的设置，并将校准镜放在显微镜下。
   3. 在“设备控制”窗口中，按“LED 控制”选项卡。打开 LED #1 并将光强度设置为所需的数字。在标准提取实验中，该值设置为 60%。
   4. 在“设备控制”窗口中按标题为图案照明工具产品名称的选项卡。然后，按 显示网格 按钮。
      注意： 网格图案将投影在校准镜上。
   5. 调整显微镜焦距和相机曝光以获得网格的高图像质量，并在需要时旋转相机以将网格线平行于相机窗口框架对齐。
   6. 选择标有图案照明工具产品名称的选项卡下的“校准向导”按钮，然后按照此窗口中软件提供的说明进行作。注意： 将打开一个第三方相机设置窗口。
   7. 将打开一个校准类型选择窗口。选择自动校准并按下一步。
   8. 当预校准调整窗口打开时，按照软件说明进行作并按下一步按钮。
   9. 当映射信息窗口打开时，将此校准相应地保存在所需的文件夹中。这是通过输入日期、显微镜名称、物镜和滤光片来完成的。
   10. 校准后，按标题为图案化照明工具产品名称的选项卡下的“工作区域定义”按钮，以根据需要定义图案化照明工具的工作区域。
6. 用于图案制备的序列设计部分。
   1. 按软件窗口左侧边栏上的序列设计按钮。然后，按 配置文件序列编辑器（Profile Sequence Editor） 按钮。
   2. 当“配置文件序列编辑器”窗口打开时，选择“配置文件列表”下的“新建配置文件”选项。
      注意：现在，将打开一个图案编辑器窗口。
   3. 如果需要，通过选择不同的图案形状和尺寸或手动绘制图案，准备所需的曝光图案。
   4. 对于块状水凝胶的圆形和断裂交叉图案，请按照步骤 8.6.5-8.6.6 进行作
   5. 对于圆形模式，在目标细菌菌落上定义一个直径为 30 μm 的圆，以覆盖整个菌落。选择形状填充颜色白色。
   6. 对于破碎的十字图案，请从图案绘制窗口中选择尺寸为 3 μm x 8 μm 的矩形形状。在目标菌落的边缘放置四个具有这些尺寸的矩形，而一半的图案与菌落有叠加层。
   7. 对于微孔阵列的圆形和环形模式，请按照步骤 8.6.8-8.6.10 进行作。
   8. 对于圆形图案，在孔周边绘制一个直径为 10 μm 的圆。选择形状填充颜色白色。
   9. 对于环形图案，画一个直径为20μm的圆圈，将其放在孔上，然后选择形状填充颜色白色。
   10. 绘制另一个直径为10μm的圆形图案，填充形状颜色为黑色，并将其放置在孔的周边。
7. 编辑图案并根据所需的提取方法修改形状。确保所需的图案存在于图案照明工具的工作区域内。
8. 将样品放入 PDMS 支架中，并将指定的培养基移液到样品顶部，以防止样品脱水，并为释放的细胞提供载体溶液。
9. 然后，将其替换为校准镜。
10. 调整显微镜焦距以获得水凝胶内菌落的清晰图像。检查菌落以确定感兴趣的菌落。
11. 在这里，设计光模式，同时相机视图显示样品内的菌落，以测试细胞提取的不同模式。
12. 保存定义的模式。保存定义的模式后，选择“会话控制”部分。
13. 在此部分中，在标题为图案化照明工具产品名称的选项卡下，添加保存的序列。
14. 添加序列后，选择模拟图案的选项，以查看和调整所需的曝光位置。
    注意：可以在此处调整样品位置，以确保图案精确地投射到目标区域。
15. 接下来，在 LED 控制选项卡下将光强度调整为 60%，将曝光时间调整为 40 秒，然后开始曝光过程。
16. 在实时和明场模式下监测水凝胶降解，以确保细胞释放。
    注意：防止样品在光照期间发生任何移动，因为它会导致水凝胶不需要的区域降解，从而导致交叉污染。

9. 细胞检索

1. 在365nm光照射和细胞释放后，使用微升注射器和微流控管收集细胞（图2）。
   注意：细胞检索需要在图案暴露后立即进行。这允许在释放的细胞远离照射区域之前进行局部细胞恢复。
2. 将显微镜从明场更改为 FITC 或 TRITC 滤光片，以便通过肉眼观察样品的暴露区域。
3. 找到暴露区域后，将管子末端放在照射点上。然后，将显微镜滤光片改回明场以实时监测细胞检索。
4. 使用连接到管道另一端的注射器小心地取出释放的细胞。取出 200 μL 溶液，将溶液插入 1.5 mL 离心管中进行 DNA 分析或铺板。

Results

图 1：硫醇化玻璃盖玻片上的水凝胶形成。 （A）将厚度为12.7μm的垫片放置在含有活性硫醇基团的基底盖玻片的两侧相对。（B）将水凝胶前体溶液移液在非反应性氟化载玻片上。（C）将非反应性载玻片放置在垫片上以形成12.7μm厚的水凝胶。（D）轻轻取出非反应性载玻片，使水凝胶附着在基底盖玻片上。（E）制备的水凝胶可以在培养基中孵育进行培养。

Materials