利用光图案化水凝胶降解实现靶向细菌菌落分离

摘要

来源： Fattahi, N.，等。用于细菌筛选、选择与分离的光降解水凝胶界面。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了利用紫外光从光降解性水凝胶中提取细菌菌落的方法。选择特定菌落后，设计特定模式的光照以引发局部水凝胶降解。在调整光照强度和持续时间后，施加紫外光，从而释放目标菌落。随后通过管路吸出菌落，并转移至离心管中，用于后续分析。

方案

1. 细菌菌株与培养方案

1. 在添加适当培养基的琼脂平板上划线接种细菌菌落。本报告中，B. subtilis（菌株1A1135，枯草芽孢杆菌遗传保藏中心）在ATGN（0.079 M KH₂PO₄（磷酸二氢钾），0.015 M (NH₄)₂SO₄（硫酸铵），0.6 mM MgSO₄·7H₂O（七水合硫酸镁），0.06 mM CaCl₂·2H₂O（二水合氯化钙），0.0071 mM MnSO₄·H₂O（一水合硫酸锰(II)），0.125 M FeSO₄·7H₂O（七水合硫酸亚铁），28 mM 葡萄糖，pH：7 ± 0.2，15 g/L 琼脂）琼脂平板上培养，并添加100 µg/mL链霉素；E. coli（菌株25922，ATCC）则在添加100 µg/mL氨苄青霉素的ATGN琼脂平板上培养。
   注意：先前关于这些材料的水凝胶包封与释放的研究使用了A. tumefaciens C58细胞
2. 从ATGN琼脂平板上挑取目标菌落，开始过夜培养。对于本实验所用的E. coli和B. subtilis菌株，在ATGN液体培养基中于37 °C、215 rpm振荡条件下培养24小时。将菌种保存于含50%甘油的冻存管中，置于-80 °C冰箱中以备后续使用。
3. 使用无菌接种环从甘油保藏菌种中挑取两种菌株的菌落，接种至ATGN液体培养基中，在37 °C、215 rpm条件下振荡培养24小时。

2. 凝胶形成所需材料的制备

1. 光降解性 PEG-o-NB-二丙烯酸酯（Poly(ethylene glycol)-ortho-nitrobenzyl-diacrylate）的合成
   注意：PEG-o-NB-二丙烯酸酯的实验室合成方法已有详尽描述并被先前报道过。此外，由于该合成属于常规操作，也可委托专业化学合成机构完成。
2. 交联缓冲液
   1. 根据所选细菌菌株培养基的配方，配制含有2倍营养成分的培养基。向培养基中加入磷酸盐，例如 NaH₂PO₄（磷酸二氢钠），使其终浓度为 100 mM。然后用 5 M NaOH（氢氧化钠）（水溶液）将 pH 值调节至 8。
   2. 将缓冲液溶液灭菌，并于 -20 °C 保存备用。
      注意：培养基中应避免添加任何过渡金属，因为这些金属会催化巯基氧化为二硫键。
3. PEG-o-NB-二丙烯酸酯溶液
   1. 每 1 mg 分装的 PEG-o-NB-二丙烯酸酯（分子量 3,400 Da）粉末，加入 3.08 µL 超纯水，以获得 49 mM 的 PEG-o-NB-二丙烯酸酯浓度（丙烯酸基团浓度为 98 mM）。
   2. 涡旋振荡使溶液充分混匀，并于 -20 °C 保存备用。
4. 四臂 PEG-巯基溶液
   1. 配制四臂 PEG-巯基（分子量 10,000 Da）时，每 1 mg 粉末加入 4 µL 超纯水，以获得 20 mM 的浓度（巯基浓度为 80 mM）。
   2. 涡旋振荡使溶液充分混匀，并于 -20 °C 保存备用。

3. 全氟烷基化（非反应性）盖玻片的制备

1. 将最多5张载玻片（25 mm × 75 mm × 1 mm）放入聚丙烯载玻片邮寄盒中。使用2%（w/v）洗涤剂溶液（材料表）对载玻片进行超声处理20分钟。
2. 用超纯水冲洗载玻片三次，然后在水中超声处理20分钟。使用氮气（N₂）气流吹干载玻片。
3. 根据第4.1节中的方案，对载玻片两面进行等离子清洗（见材料表），处理时间为2分钟。
4. 将经等离子清洗后的载玻片放回载玻片邮寄盒中，并向容器内加入0.5%（v/v）的三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷甲苯溶液。在室温（RT）下静置3小时，使载玻片完成表面功能化。
5. 载玻片功能化完成后，在载玻片邮寄盒内依次用甲苯和乙醇冲洗（每种溶剂各冲洗三次）。随后，用氮气（N₂）气流吹干每张功能化载玻片。

4. 巯基功能化（基底）盖玻片的制备

1. 使用等离子清洗机清洁玻璃盖玻片
   1. 将 18 mm × 18 mm 的盖玻片放入培养皿中，然后将培养皿置于等离子清洗机腔室内，并开启等离子清洗机电源。
   2. 启动真空泵，清除腔室内的空气，直至压力表读数为 400 mTorr。
   3. 打开计量阀，使空气进入腔室，直至压力表达到稳定压力（800–1000 mTorr）。然后选择“Hi”模式的射频（RF），对盖玻片处理 3 分钟。
   4. 3 分钟后，关闭射频模式和真空泵。
   5. 将培养皿从腔室中取出，翻转盖玻片，再将其放回腔室中进行等离子处理，以暴露玻璃盖玻片的另一面。
   6. 重复步骤 4.1.2–4.1.4，用等离子体清洁玻璃盖玻片未处理的一侧。
   7. 完成处理后，将培养皿从腔室中取出，并关闭等离子清洗机和真空泵。
2. 使用piranha溶液清洁并羟基化盖玻片
   注意：可采用标准的piranha溶液清洗方案对玻璃盖玻片进行清洁和羟基化处理。Piranha溶液是体积比为30:70（v/v）的H₂O₂（过氧化氢）和H₂SO₄（硫酸）混合液。也可使用其他清洁玻璃盖玻片的方法。
   警告：Piranha溶液具有强腐蚀性，并能与有机溶剂发生剧烈爆炸，必须极其小心地操作。应采取适当的安全和防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备（实验服、耐化学围裙、护目镜、面罩、耐酸丁基手套）。所有接触piranha溶液的玻璃器皿和工作表面在使用前必须清洁、干燥且无有机残留物。Piranha溶液绝不能储存在半封闭或密闭容器中。
   1. 在通风橱内，将一个洁净的 100 mm × 50 mm 玻璃皿放置于可调搅拌速度的加热磁力搅拌器上，并向其中加入 14 mL H₂O₄。
   2. 使用聚四氟乙烯（Teflon）涂层镊子将一个小的Teflon涂层磁力搅拌子轻轻放入玻璃皿中，然后缓慢启动搅拌器，避免酸液飞溅。
   3. 接下来，缓慢加入 6 mL H₂O₂，并让溶液充分混合。
   4. 关闭搅拌器，用镊子将搅拌子从玻璃皿中取出。然后用镊子轻轻将盖玻片放入玻璃皿中，并将温度设定为 60–80 °C。
   5. 30 分钟后，用镊子轻轻取出盖玻片，并将其浸入去离子水（DI水）中两次，以洗去残留的piranha溶液。
   6. 用水冲洗后，将盖玻片保存在室温下的去离子水中，待后续使用。
   7. 关闭加热板，使piranha溶液冷却。
   8. 处理废弃的piranha溶液时，将装有已冷却piranha溶液的 100 mm × 50 mm 玻璃皿小心放入一个容量至少为 1.5 L 的更大空玻璃烧杯中。然后加入 1 L 水进行稀释，并加入碳酸氢钠粉末进行中和。注意：碳酸氢钠会引起冒泡和放热，必须缓慢加入；否则冒泡可能导致酸液飞溅。当继续添加碳酸氢钠不再产生气泡时，用pH试纸检测溶液pH值，确认其已被中和。待溶液完全中和并冷却后，可将其倒入下水道。
3. 盖玻片的巯基功能化处理
   1. 在干燥甲苯中配制体积分数为 5%（v/v）的 269 mM (3-巯丙基)三甲氧基硅烷（MPTS）溶液。
   2. 将 10 mL 上述溶液分别加入多个 50 mL 圆锥形离心管中。每根管中放入一片已清洁的盖玻片，并完全浸没于溶液中。
      注意：每根 50 mL 管仅使用一片盖玻片，以确保基底两面均能充分巯基化，且不受其他基底干扰。
   3. 4 小时后，依次用甲苯、体积比为 1:1（v/v）的乙醇-甲苯混合液和乙醇对每片盖玻片进行洗涤（每片盖玻片各洗涤四次）。
      注意：此步骤通过将每片盖玻片依次浸入装有上述溶液的圆锥形离心管中完成。
   4. 冲洗基底后，将其浸入乙醇中，并在 4 °C 下保存，待后续使用。
      注意：根据盖玻片数量的不同，该方法可能因需逐个处理而变得繁琐。对于多个盖玻片，可使用可同时容纳多片盖玻片的哥伦比亚瓶（Columbia jars）。

5. 硅微孔阵列的制备

1. 聚对二甲苯涂层：采用先前研究文章中描述的标准方案，对硅片进行聚对二甲苯涂层处理。
2. 微加工：遵循 Barua 等人所述的方案，设计并制备微孔阵列。​

6. 水凝胶的形成

1. 在玻璃盖玻片上形成大块水凝胶
   1. 水凝胶前体溶液：向一个0.5 mL微量离心管中加入12.5 µL交联缓冲液，随后加入5.6 µL PEG-o-NB-二丙烯酸酯溶液。最后，向混合物中加入6.9 µL四臂PEG-硫醇溶液。
      注意：将4臂PEG硫醇加入混合物后即引发交联反应，因此水凝胶前体溶液应在混合后立即使用。
   2. 进行细胞在水凝胶前体溶液中的包封时，遵循步骤6.1.3–6.1.9。
   3. 进行细胞包封时，在步骤6.1.1之前，用所需细胞密度接种交联缓冲液。如先前报道所述19，观察到细胞密度为7.26 × 10⁷ CFU/mL 在交联缓冲液中对应于约 90 个细胞/mm 的密度² 在水凝胶中被包封。
   4. 将巯基化处理的盖玻片置于洁净的培养皿中。放置两个间隔片（参见 材料表) 在盖玻片相对的两侧。
      注意盖玻片的巯基功能化对于水凝胶与盖玻片表面的共价结合至关重要。该过程通过盖玻片表面的巯基与水凝胶前体溶液中的丙烯酸酯基团发生反应而实现。
   5. 用胶带将垫片固定在培养皿底部的盖玻片上。
   6. 将所需体积的前驱体溶液用移液器滴加到惰性全氟烷基化玻璃载片上。
   7. 将全氟烷基化玻璃载片放置在底盖玻片上（图1C）。室温下静置25分钟，使水凝胶完全形成。
   8. 凝胶化后，轻轻移除全氟烷基化玻璃载片，水凝胶将保留在底部盖玻片上。​
      注意：对于18 mm × 8 mm的盖玻片，若要制备厚度为12.7 µm的膜，使用约7 µL前驱体溶液（图1A、B）。使用过多的前体溶液可能导致在底部盖玻片下方形成水凝胶，这会使底部盖玻片黏附于培养皿上，在尝试取出时容易破裂。此外，盖玻片下方残留的水凝胶会对显微镜观察造成干扰。去除非反应性的全氟烷基化玻璃盖片时需轻柔操作，快速移除可能损伤水凝胶。
   9. 将底物置于含有指定培养基的 60 mm × 15 mm 培养皿中。此处使用添加了 100 µg/mL 奇霉素的 ATGN 培养基 枯草芽孢杆菌 或含100 µg/mL氨苄青霉素的培养基 E.coli 在37 °C下培养24小时。

7. 细胞提取的材料准备

1. PDMS（聚二甲基硅氧烷）支架制备
   1. 将十片18 × 18 mm的盖玻片叠放在一起并用胶带固定，然后将此盖玻片堆叠体粘接到培养皿底部。
   2. 制备PDMS支架时，按10:1的体积比在塑料杯中混合PDMS预聚物与固化剂，在真空干燥器中脱气，随后将混合物倒入培养皿中。
   3. 在80 °C下固化PDMS 90分钟。然后沿胶带固定的区域切割，取出PDMS支架，并将其放置在载玻片上，以便显微镜下操作。
2. 微量注射器和管路制备
   1. 截取20 cm长的PTFE（聚四氟乙烯）管路（内径0.05英寸），并将管路一端连接至100 µL微量注射器。
      注意：进行提取时，避免使用移液器，因为通过移液器吸头吸取释放的细胞可能损伤水凝胶表面并导致污染。

8. 使用图案化照明工具进行水凝胶降解

1. 打开显微镜（参见 材料表）。然后，打开图案化照明工具（参见 材料表).
2. 打开365 nm LED光源模拟和数字控制模块，然后打开LED光源控制模块。
3. 打开显微镜软件和图案化照明工具的软件。当硬件配置窗口打开后，选择“加载”按钮。
   注意：此处将加载三个设备。（第三方摄像头、控制模块和图案化照明工具）
4. 按下开始按钮，光刻软件窗口将打开。在窗口左侧边栏中选择第一个选项，即设备控制按钮。
5. 校准图案化照明工具。
   注意校准必须使用与光照射时相同的显微镜物镜和滤光片进行。
   1. 将显微镜物镜设为10倍放大。
      注意该放大倍数可在显微镜镜头与样品表面之间提供足够的工作距离，同时可通过图像窗口实时监测和记录提取过程。
   2. 将显微镜物镜和滤光片设置为光照射所用的参数，并将校准镜置于显微镜下。
   3. 在设备控制窗口中，按下 LED 控制选项卡。打开 LED #1，并将光强度设置为所需数值。在标准提取实验中，该值通常设为 60%。
   4. 在设备控制窗口中，点击标有图案照明工具产品名称的选项卡，然后点击显示网格按钮。
      注意校准镜上将投射出网格图案。
   5. 调整显微镜焦距和相机曝光，以获得网格的高质量图像，并在需要时旋转相机，使网格线与相机窗口框架平行。
   6. 单击以图案化照明工具产品名称命名的选项卡下方的“校准向导”按钮，并按照此窗口中软件提供的说明进行操作。 注：将打开第三方相机设置窗口。
   7. 将打开校准类型选择窗口。选择自动校准，然后点击下一步。
   8. 当预校准调整窗口打开时，按照软件提示操作并点击“下一步”按钮。
   9. 当“映射信息”窗口打开时，将此校准信息保存至目标文件夹。具体操作为输入日期、显微镜名称、物镜和滤光片。
   10. 校准后，如有需要，按下标签页中以图案化照明工具产品名称命名的选项卡下的“工作区域定义”按钮，以定义图案化照明工具的工作区域。
6. 用于图案制备的序列设计部分。
   1. 单击软件窗口左侧边栏中的“序列设计”按钮，然后单击“谱图序列编辑器”按钮。
   2. 当“配置文件序列编辑器”窗口打开后，在配置文件列表中选择“新建配置文件”选项。
      注意此时将打开一个图案编辑器窗口。
   3. 通过选择不同的图案形状和大小，或根据需要手动绘制图案，来准备所需的光照曝光图案。
   4. 对于块状水凝胶的圆形和断十字图案，遵循步骤 8.6.5–8.6.6
   5. 对于圆形图案，定义一个直径为 30 µm 的圆形，覆盖目标细菌菌落的整个区域。选择形状填充颜色为白色。
   6. 对于断裂的十字图案，从图案绘制窗口中选择尺寸为 3 µm × 8 µm 的矩形形状。将四个具有该尺寸的矩形放置在目标菌落的边缘，其中一半图案与菌落部分重叠。
   7. 对于微孔阵列的圆形和环形图案，请遵循步骤 8.6.8-8.6.10。
   8. 对于圆形图案，在孔周围绘制一个直径为10 µm的圆。选择形状填充颜色为白色。
   9. 对于环形图案，绘制一个直径为 20 µm 的圆，将其覆盖在孔上，并选择形状填充颜色为白色。
   10. 用黑色填充形状绘制另一个直径为 10 µm 的圆形图案，并将其放置在孔的周边。
7. 根据所需的提取方法编辑图案并修改形状。确保所需图案位于图案化照明工具的工作区域内。
8. 将样品置于PDMS持载器中，并用移液器在样品上方加入指定培养基，以防止样品脱水，并为释放的细胞提供载体溶液。
9. 然后，用校准镜替换此部件。
10. 调节显微镜焦距，以获得水凝胶内菌落的清晰图像。检查菌落，识别出感兴趣的菌落。
11. 在此处设计光斑图案，同时通过相机视图观察样品内的菌落，以测试不同的细胞提取图案。
12. 保存已定义的模式。保存后，选择会话控制部分。
13. 在本节中，于标有图案照明工具产品名称的标签页下，添加已保存的序列。
14. 添加序列后，选择模拟图案的选项，以查看并调整曝光位置至理想区域。
    注意：可在此处调整样品位置，以确保图案精确投射到目标区域。
15. 接下来，在LED控制选项卡下将光强调整为60%，曝光时间调整为40秒，然后开始曝光过程。
16. 实时在明场模式下监测水凝胶降解，以确保细胞释放。
    注意光照期间应防止样品发生任何移动，以免导致水凝胶非目标区域的降解，从而引起交叉污染。

9. 细胞回收

1. 在365 nm光照处理并释放细胞后，使用微升注射器和微流控管路收集细胞（图2）。
   注意：细胞回收必须在图案曝光后立即进行，以便在释放的细胞离开照射区域前完成局部细胞回收。
2. 将显微镜从明场切换至FITC或TRITC滤光片，以便肉眼观察样品的曝光区域。
3. 确定曝光区域位置后，将管路末端置于照射位点上。随后，将显微镜滤光片切换回明场模式，以实时监测细胞回收过程。
4. 使用连接在管路另一端的注射器小心吸取释放的细胞，吸取200 µL溶液，并将其转移至1.5 mL离心管中，用于DNA分析或铺板。

结果

图1：在巯基化玻璃盖玻片上形成水凝胶。 （A）将厚度为12.7 µm的间隔片放置在含有反应性巯基的基底盖玻片的两侧。（B）将水凝胶前体溶液用移液枪点加到非反应性的氟化玻璃载片上。（C）将非反应性玻璃载片置于间隔片上，以形成厚度为12.7 µm的水凝胶。（D）轻轻移除非反应性玻璃载片，使水凝胶保留在基底盖玻片上。（E）制备好的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(3-巯丙基)三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95%
Alconox 洗涤剂粉末	Alconox	1104
硫酸铵	Fisher Chemical	A702-500	分析纯级颗粒
高压灭菌器 SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	枯草芽孢杆菌遗传保藏中心	1A1135
明场直立显微镜	奥林巴斯公司	BX51
无水氯化钙	Fisher Chemical	C614-500	干燥器用颗粒，4-20 目
离心机 5702	Eppendorf	5702
一水柠檬酸	Sigma-Aldrich	C1909-500G	分析纯试剂，> 99.0%
D-葡萄糖（右旋糖）	VWR Amresco 生命科学	0188-1KG
DOWSIL 184 硅橡胶基础剂	道康宁公司		储存温度：-30–60 °C
DOWSIL 184 硅橡胶固化剂	道康宁公司		储存温度：< 32 °C
EPOCH2 微孔板分光光度计	BioTek 仪器公司	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	赛默飞世尔科技	R19020
无水乙醇	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand 显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12540A
Fisherfinest 高级普通显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-4
过氧化氢溶液	Sigma-Aldrich	216763-500ML	含抑制剂，H₂O 中含量为 30 wt%
Incu-Shaker Mini 恒温振荡器	Benchmark	E5-0014-01
异丙醇	Sigma-Aldrich	190764
七水合硫酸镁	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
甲醇	Sigma-Aldrich	179337-4L	分析纯试剂，> 99.8%
NanoDrop One 分光光度计	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
压缩氮气	Matheson	UN1066
氧气等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-001-HP
季戊四醇四（巯乙基）聚氧乙烯（4 臂 PEG）	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
磷酸盐缓冲液 (PBS)，10X	VWR Amresco 生命科学	K813-500ML	储存温度：15 °C–30 °C
聚二甲基硅氧烷 (PDMS) Slygard 184	道康宁公司	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
高级显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
氯化钠	Sigma 生命科学	S5886-500G	生物试剂，适用于细胞培养
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra，> 98%，颗粒状（无水）
二水合磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra，适用于分子生物学，> 99.0% (T)
不锈钢测厚规	Precision Brand Products	77739
硫酸	Sigma-Aldrich	320501-2.5L
无水甲苯，99.8%	Sigma-Aldrich	244511-1L	无水，> 99.8%
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷 (TPS)，97%	Sigma-Aldrich	448931-10G
胰蛋白胨大豆肉汤	Sigma-Aldrich	22092-500G	用于微生物学
超声波清洗器	Fischer Scientific	FS-110H