采用糖醛酸咔唑法测定细菌海藻酸盐含量

摘要

来源： Al Ahmar, R. 等小型菌落变体的培养 铜绿假单胞菌 及其海藻酸盐的定量 视频实验杂志 (2020)

本视频演示了一种比色法，用于定量铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的藻酸盐，该方法通过酸水解后使用咔唑检测糖醛酸。该方法可在科研和临床研究中实现以细菌生物量为归一化标准的藻酸盐产量比较分析。

方案

1. 糖醛酸咔唑测定法

1. 从待测目标菌株的纯培养物中挑取单个菌落。使用无菌牙签挑取该菌落，并将牙签放入含有5 mL Pseudomonas 分离肉汤（PIB）的培养试管中。在37 °C条件下，于摇床培养箱中培养24 h。
   注意：以下菌株PAO581（PAO1mucA25）、PAO581carA、PAO581carB和PAO581pyrD均在Pseudomonas分离琼脂（PIA）平板或补充有0.1 mM尿嘧啶的PIA平板上培养，以收获用于测定的藻酸盐。
2. 在预热的PIA平板上，加入150 µL培养后的PIB肉汤（适用于15 mm × 100 mm平板）或450 µL肉汤（适用于15 mm × 150 mm平板）。使用无菌涂布棒将肉汤均匀涂布于平板表面。在37 °C条件下培养24 h。
   注意：如有过量液体，可将平板倾斜，用移液器吸除。本实验所用的PIB和PIA平板均含有20 mL/L甘油，细胞可利用其作为碳源以促进藻酸盐的生成。
3. 使用移液控制器和无菌50 mL移液管，向已长出菌苔的平板中加入0.85% NaCl（氯化钠）溶液，并用涂布棒刮取菌苔以收集样品。用新的50 mL移液管将样品吸入50 mL收集管中。在高速下涡旋振荡样品以混匀，并将样品置于冰上。
   注意：加入的0.85% NaCl体积根据平板大小而定：对于15 mm × 100 mm平板，使用10−30 mL；对于15 mm × 150 mm平板，使用20−50 mL。
4. 通过向一次性比色皿中加入1 mL样品，并使用分光光度计测定600 nm处的光密度（OD₆₀₀）来测量样品的光密度。对每个样品重复此步骤两次，以获得三份读数。
5. 向培养管中加入3 mL硫酸/硼酸溶液，并将其置于冰上静置。缓慢向试管中的酸混合液中加入350 µL收集的样品，并短暂低速涡旋振荡。
   1. 通过将10.099 g氢氧化钾（KOH）粉末加入45 mL水中配制硼酸储备液。再向其中加入24.74 g硼酸（H₃BO₃），定容至100 mL。
   2. 将一个1 L试剂瓶置于装有冰的水槽中，加入500 mL浓硫酸。缓慢加入15 mL已配制的硼酸储备液。待瓶体冷却。
   3. 再加入10 mL硼酸储备液，总量达25 mL。待瓶体冷却后，加水定容至1 L。
      注意：该方法涉及使用高浓度硫酸，应穿戴适当的个人防护装备以确保安全，并遵循样品的正确处置规程。
      注意：阳性对照可采用已知浓度的D-甘露糖醛酸和/或通过产藻酸盐的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株（如PAO581-PAO1mucA25）提取并纯化的细菌藻酸盐样品。阴性对照可使用0.85% NaCl溶液和/或PAO1ΔalgD（algD基因的框内缺失突变株，完全丧失产藻酸盐能力）。每个样品可制备多个试管，以增加技术重复数，便于统计分析。每种样品准备3−5个试管。
6. 向酸/样品混合液中加入100 µL 0.1%卡巴唑乙醇溶液。盖紧管盖，在中等速度下涡旋振荡5 s。将试管置于55 °C干浴中反应30 min。
7. 孵育结束后，取出试管，高速短暂涡旋振荡，然后静置冷却5 min。
   注意：反应后应呈现紫色色调。该颜色在1−2 h内保持稳定，适合进行测定。
8. 通过向洁净比色皿中加入1 mL混合液，并在分光光度计上于530 nm处测定各管的OD₅₃₀值。使用含0.85% NaCl溶液的试管作为空白对照。
9. 通过测定已知浓度的D-甘露糖醛酸系列稀释液（1,024 µg/mL、512 µg/mL、256 µg/mL、128 µg/mL、64 µg/mL、32 µg/mL、16 µg/mL和8 µg/mL）的OD₅₃₀值绘制标准曲线。重复测定两次。根据这些读数拟合线性方程。
   注意：标准曲线仅需建立一次，所得线性方程可用于后续检测。
   1. 利用标准曲线计算各样品中藻酸盐的浓度，并将线性方程得出的藻酸盐浓度除以OD₆₀₀，得到每单位OD₆₀₀的总藻酸盐含量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accu Block 数字干浴器	Labnet	NC0205808	通过 Fisher Scientific 购买
台式涡旋混合器 Vortex-Genie 2	Scientific Industries	G560
硼酸	Research Products International Corp.	10043-35-3
培养箱	VWR	1540
咔唑	Sigma	C-5132
离心管（50 ml）	Fisher Scientific	05-539-13	通过 Fisher Scientific 购买
培养试管	Fisher Scientific	14-956-6D	通过 Fisher Scientific 购买
聚苯乙烯比色皿（1.5 ml）	Fisher Scientific	14955127	通过 Fisher Scientific 购买
一次性接种环	Fisher Scientific	22-363-597
D-甘露糖醛酸钠	Sigma Aldrich	SMB00280
甘油	Fisher Scientific	BP906-5	分子生物学级
磷酸盐缓冲液粉末（PBS）	Sigma	P3813
假单胞菌分离琼脂（PIA）	Difco	292710	通过 Fisher Scientific 购买
假单胞菌分离肉汤（PIB）	Alpha Biosciences	P16-115	通过 Fisher Scientific 购买
圆形牙签	Diamond		任意品牌
SmartSpec Plus 分光光度计	BioRad	170-2525	或选用其他 preferred vendor
氯化钠（NaCl）	Sigma	S-5886
无菌培养皿 100 mm × 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	通过 Fisher Scientific 购买
硫酸	Fisher Scientific	A298-212	技术级
硫酸（2 N - 终止液）	R&D Systems	DY994