利用基于抗体的酶联免疫吸附测定法定量细菌海藻酸盐

摘要

来源： Al Ahmar, R., 等小型菌落变体的培养 铜绿假单胞菌 及其海藻酸盐的定量 视频实验杂志 (2020)

本视频演示了一种比色免疫测定法，用于定量分析铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的保护性胞外多糖——海藻酸盐。该方法包括将样品包被于微孔板上，加入特异性抗体，并利用酶-底物反应产生可测量的颜色变化。随后根据样品的颜色强度，通过标准曲线确定海藻酸盐的浓度。

方案

1. 藻酸盐定量的ELISA

1. 使用微量移液器，将50 µL收集的样本加入未经处理的96孔板中。向孔中加入50 µL包被缓冲液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6）。将板在37 °C孵育2小时。

注意： 阳性对照可使用已知浓度的D-甘露糖醛酸和/或已知稳定产藻酸盐的菌株（例如 PAO581-PAO1mucA25）。阴性对照使用0.85% NaCl溶液和/或PAO1ΔalgD（algD基因的框内缺失使细菌完全无法产生任何藻酸盐）。每个样品可设置多个孔，以增加技术重复次数，便于进行统计分析。每种样品准备3−5个孔。

2. 使用喷瓶，用含 0.05% Tween 20 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS-T）清洗平板孔 2 次：将孔注满液体后，翻转平板倒出液体。

3. 使用微量移液器向孔中加入 200 µL 封闭缓冲液（含 10% 脱脂奶粉的 PBS-T）。4 °C 过夜孵育。

注意：用石蜡膜或收缩膜包裹培养板，以避免在冰箱中发生蒸发。

4. 使用冲洗瓶，用 PBS-T 洗涤....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一步法超敏TMB-ELISA试剂盒	Thermo Scientific	34028	通过 Fisher Scientific 购买
96孔检测板	CoStar	2021-12-20
碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液	Sigma	C3041
离心管（50 mL）	Fisher Scientific	05-539-13	通过 Fisher Scientific 购买
培养试管	Fisher Scientific	14-956-6D	通过 Fisher Scientific 购买
比色皿 聚苯乙烯材质（1.5 mL）	Fisher Scientific	14955127	通过 Fisher Scientific 购买
D-甘露糖醛酸钠	Sigma Aldrich	SMB00280
FMC 海藻酸盐	FMC	2133
小鼠抗海藻酸盐单克隆抗体	QED Biosciences	N/A	批号 # :15725/15726
磷酸盐缓冲液粉末（PBS）	Sigma	P3813
Pierce 山羊抗小鼠多聚辣根过氧化物酶标记二抗	Thermo Scientific	32230	通过 Fisher Scientific 购买
圆形牙签	Diamond		任意品牌
海藻来源海藻酸盐（Protanal CR 8133）	FMC Corporation
脱脂奶粉	Difco	232100	通过 Fisher Scientific 购买
SmartSpec Plus 分光光度计	BioRad	170-2525	或其他常用供应商
氯化钠（NaCl）	Sigma	S-5886
SpectraMax i3x 多功能微孔板读板仪	Molecular Devices	i3x	或其他常用供应商
硫酸（2 N，终止液）	R&D Systems	DY994
吐温20（Tween 20）	Sigma	P2287