来源： Al Ahmar, R., 等小型菌落变体的培养 铜绿假单胞菌 及其海藻酸盐的定量 视频实验杂志 (2020)
本视频演示了一种比色免疫测定法，用于定量分析铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的保护性胞外多糖——海藻酸盐。该方法包括将样品包被于微孔板上，加入特异性抗体，并利用酶-底物反应产生可测量的颜色变化。随后根据样品的颜色强度，通过标准曲线确定海藻酸盐的浓度。
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方法文章
利用基于抗体的酶联免疫吸附测定法定量细菌海藻酸盐
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2025年9月26日
本文内容
摘要
方案
1. 藻酸盐定量的ELISA
1. 使用微量移液器，将50 µL收集的样本加入未经处理的96孔板中。向孔中加入50 µL包被缓冲液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6）。将板在37 °C孵育2小时。
注意： 阳性对照可使用已知浓度的D-甘露糖醛酸和/或已知稳定产藻酸盐的菌株（例如 PAO581-PAO1mucA25）。阴性对照使用0.85% NaCl溶液和/或PAO1ΔalgD（algD基因的框内缺失使细菌完全无法产生任何藻酸盐）。每个样品可设置多个孔，以增加技术重复次数，便于进行统计分析。每种样品准备3−5个孔。
2. 使用喷瓶，用含 0.05% Tween 20 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS-T）清洗平板孔 2 次：将孔注满液体后，翻转平板倒出液体。
3. 使用微量移液器向孔中加入 200 µL 封闭缓冲液（含 10% 脱脂奶粉的 PBS-T）。4 °C 过夜孵育。
注意：用石蜡膜或收缩膜包裹培养板，以避免在冰箱中发生蒸发。
4. 使用冲洗瓶，用 PBS-T 洗涤酶标板孔 2 次，每次将孔注满后，翻转酶标板倒出液体。
5. 使用微量移液器向各孔中加入 100 µL 稀释的一抗（小鼠抗海藻酸单克隆抗体），于 37 °C 孵育 1−2 小时。
注意：一抗（小鼠抗海藻酸单克隆抗体）使用抗体稀释液（含1%脱脂奶粉的1×PBS）配制，终浓度为0.5 µg/mL（将1 mg/mL的原液按1:2,000比例稀释）。
6. 使用冲洗瓶，用 PBS-T 清洗平板孔 3 次，每次注满孔后，将平板翻转倒出液体。
7. 使用微量移液器向孔中加入 100 µL 稀释的二抗，在 37 °C 孵育 1−2 小时。
注意：所使用的二抗为 Pierce 羊抗小鼠多克隆辣根过氧化物酶（HRP）抗体，用抗体稀释液稀释至浓度为 0.25 µg/mL（将 0.5 mg/mL 的原液按 1:2,000 比例稀释）。
8. 使用冲洗瓶，用 PBS-T 洗涤酶标板孔 3 次，每次将孔注满后，翻转酶标板倒出液体。
9. 使用微量移液器加入 100 µL TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）-ELISA（酶联免疫吸附测定）溶液（材料表），于室温避光孵育 30 分钟。
注意：阳性反应的颜色为不同程度的蓝色。
10. 使用移液器加入 100 µL 终止液（2 N 硫酸）。
注意：加入终止液后，颜色将由蓝色变为黄色。反应终止后，颜色在30分钟内保持稳定。
11. 使用酶标仪在 450 nm 处读取光密度值。
12. 通过测量OD值绘制标准曲线450 已知浓度的系列稀释液 D-甘露糖醛酸（1,024 µg/mL、512 µg/mL、256 µg/mL、128 µg/mL、64 µg/mL、32 µg/mL、16 µg/mL 和 8 µg/mL）。重复两次。根据这些读数拟合线性方程。
注意：标准曲线只需进行一次。从中获得的线性方程可用于后续检测。
1. 使用标准曲线计算每个样品中海藻酸盐的浓度，并将线性方程得到的海藻酸盐浓度除以 OD600，以获得每单位 OD600 的总海藻酸盐量。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 一步法超敏TMB-ELISA试剂盒 | Thermo Scientific | 34028 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| 96孔检测板 | CoStar | 2021-12-20 | |
| 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液 | Sigma | C3041 | |
| 离心管（50 mL） | Fisher Scientific | 05-539-13 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| 培养试管 | Fisher Scientific | 14-956-6D | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| 比色皿 聚苯乙烯材质（1.5 mL） | Fisher Scientific | 14955127 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| D-甘露糖醛酸钠 | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC 海藻酸盐 | FMC | 2133 | |
| 小鼠抗海藻酸盐单克隆抗体 | QED Biosciences | N/A | 批号 # :15725/15726 |
| 磷酸盐缓冲液粉末（PBS） | Sigma | P3813 | |
| Pierce 山羊抗小鼠多聚辣根过氧化物酶标记二抗 | Thermo Scientific | 32230 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| 圆形牙签 | Diamond | 任意品牌 | |
| 海藻来源海藻酸盐（Protanal CR 8133） | FMC Corporation | ||
| 脱脂奶粉 | Difco | 232100 | 通过 Fisher Scientific 购买 |
| SmartSpec Plus 分光光度计 | BioRad | 170-2525 | 或其他常用供应商 |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x 多功能微孔板读板仪 | Molecular Devices | i3x | 或其他常用供应商 |
| 硫酸（2 N，终止液） | R&D Systems | DY994 | |
| 吐温20（Tween 20） | Sigma | P2287 |
