使用基于抗体的酶联免疫吸附测定法定量细菌海藻酸盐

摘要

资料来源： Al Ahmar， R. 等人。 铜绿假单胞 菌小菌落变异体的培养及其海藻酸盐的定量。 J. Vis. Exp. （2020年）

该视频演示了一种比色免疫测定法，用于定量海藻酸盐，海藻酸盐是一种由 铜绿假单胞菌产生的保护性胞外多糖。该过程包括用样品涂覆微孔板，应用特异性抗体，并使用酶-底物反应产生可测量的颜色变化。然后使用标准曲线根据样品的颜色强度确定海藻酸盐浓度。

方案

1. 用于海藻酸盐定量的 ELISA

1. 使用微量移液器，将 50 μL 收集的样品加入未经处理的 96 孔板中。向孔中加入 50 μL 包被缓冲液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 pH 9.6）。将板在 37°C 下孵育 2 小时。

注意： 对于阳性对照，可以使用已知浓度的 D-甘露糖醛酸和/或已知稳定的海藻酸盐生产菌株（例如 PAO581-PAO1mucA25）。对于阴性对照，使用 0.85% NaCl 溶液和/或 PAO1ΔalgD （ algD 基因的框内缺失使细菌完全无法产生任何藻酸盐）。每个样品可以制作多个孔，以增加技术重复次数，以帮助进行统计分析。每个样品制备 3−5 孔。

2.使用喷瓶，通过填充孔，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）和0.05%吐温20（PBS-T）洗涤板孔2次，然后通过翻转板将其排空。

3. 使用微量移液器，向孔中加入 200 μL 封闭缓冲液（PBS-T 中的 10% 脱脂牛奶）。在4°C下孵育过夜。

注意： 用石蜡薄膜或收缩膜包裹盘子，以帮助避免冰箱中蒸发。

4.使用喷瓶，通过填充孔，用PBS-T洗涤板孔2次，然后通过翻转板将其排干。

5. 使用微量移液器，将 100 μL 稀释的一抗（小鼠抗藻酸盐单克隆抗体）加入孔中，并在 37 °C 下孵育 1-2 小时。

注意： 一抗（小鼠抗藻酸盐单克隆抗体）以0.5μg/mL（1mg/mL原液的1：2,000稀释）在抗体稀释溶液（1x PBS中的1%脱脂牛奶）中提供。

6.使用喷瓶，通过填充孔，用PBS-T洗涤板孔3次，然后通过翻转板将其排空。

7. 使用微量移液器，向孔中加入 100 μL 稀释的二抗，并在 37 °C 下孵育 1-2 小时。

注意： 使用的二抗是穿山羊抗小鼠聚辣根过氧化物酶 （HRP） 抗体，在抗体稀释溶液中的浓度为 0.25 μg/mL（0.5 mg/mL 原液的 1：2,000 稀释）。

8.使用喷瓶，通过填充孔，用PBS-T洗涤板孔3次，然后通过翻转板将其排干。

9. 使用微量移液器，加入 100 μL TMB（3,3'，5,5'-四甲基联苯胺）-ELISA（酶联免疫吸附测定）溶液（材料表），并在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。

注意： 积极反应的颜色将是蓝色阴影。

10. 使用微量移液器，加入 100 μL 终止溶液（2 N 硫酸）。

注意： 添加终止液时，颜色将从蓝色变为黄色。反应停止后颜色稳定长达 30 分钟。

11. 使用酶标仪读取 450 nm 处的外径。

12. 通过测量已知浓度的 D-甘露糖酸（1,024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL 和 8 μg/mL）的连续稀释液的 OD₄₅₀ 来生成标准曲线。重复 2 次。从这些读数中，提取一个线性方程。

注意： 标准曲线只需执行一次。从中提取的线性方程可用于以后的测试。

1.使用标准曲线计算每个样品中海藻酸盐的浓度，并将线性方程中的海藻酸盐浓度除以OD₆₀₀ ，得到每OD₆₀₀的海藻酸盐总量。

材料