建立小鼠阴道厌氧菌定植模型

摘要

来源：Morrill, S. R., et al. 厌氧培养细菌建立小鼠阴道定植模型。J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了一种利用耐抗生素厌氧菌在小鼠中建立阴道定植模型的实验方案。首先通过激素处理增强上皮细胞的易感性，随后在厌氧条件下进行阴道接种及共接种操作。实验最后通过接种后的取样与培养，评估细菌定植情况及生物膜的形成。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 接种物的制备

注意：本部分包含从厌氧培养的链霉素抗性Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR制备接种物的一般步骤。本部分所有操作均应在厌氧工作站内进行。

1. 将所有试剂（包括配制好的纽约市肉汤III（NYCIII）、琼脂和磷酸盐缓冲液（PBS））放入厌氧舱内，至少平衡24小时后再使用。
   注意： 此处使用了一个以5%氢气混合气体平衡的乙烯厌氧舱。舱内氧气浓度通常维持在0 ppm，但在将物品放入舱内时，可能会出现短暂的低水平上升（10–25 ppm）。
2. 阴道接种前两天，进行划线接种 加德纳菌 从冻存的甘油菌种中取出菌液，在厌氧培养箱内接种至NYC III琼脂平板上。在将甘油菌种带入和带出培养箱的过程中，使用装有干冰的小容器（如空的移液枪头盒）以保持菌种处于冷冻状态。
3. 阴道接种前一天，使用5-10只个体 加德纳菌属 从平板上挑取菌落接种于10 mL NYC III肉汤中。将液体培养物在37℃下培养过夜16小时。 °C. 取1 mL未接种的培养基作为对照，与接种后的培养物一同孵育，以确认培养基无污染。
4. 按照下述方法从液体培养物中制备接种物。尽可能在厌氧环境中进行接种物的制备。
   1. 测定培养物的光密度（OD），加入 200 µ800 L 培养物 µ在1.5 mL比色皿中加入新鲜培养基（1:5稀释）。使用分光光度计在600 nm波长下测定稀释后菌液的密度（OD），以另一只仅含新鲜培养基的比色皿作为空白对照。将测得的OD值乘以5，得到实际OD值。₆₀₀ 16小时培养物的
   2. 计算实验所需的接种物体积。例如，用 20 的接种量感染 15 只小鼠时 µ每只小鼠 L，15 × 20 µL = 300 µ接种液需要 L。准备的接种液量应比实际需求多约 25%，因此对于 15 只小鼠，需准备 300 µL + (0.25 × 300 µL) = 375 µ接种物的升数。
   3. 使用OD₆₀₀ 根据步骤1.4.1中确定的结果，计算需要离心并重悬的16小时培养物体积，以获得目标OD值₆₀₀ = 5.0 接种量，体积按步骤 1.4.2 计算。例如，如果 OD₆₀₀ 培养物的OD值为1.5，所需接种量为375 µL，那么需要离心的培养物体积为（375 µL × 5 ÷ 1.5 = 1250 µL.
   4. 用移液器将步骤 1.4.3 中计算出的培养物体积转移至无菌微量离心管中。在 16,000 x g 条件下离心，沉淀细菌。 g 1-3 分钟。
   5. 移除上清液，并将沉淀重悬于步骤1.4.2中计算体积的厌氧PBS中。此时接种物的OD值为计算所得₆₀₀ 5.0。如适用，还需准备一管PBS，作为未感染对照组小鼠的阴性对照。
5. 在将接种液试管从厌氧舱中取出之前，准备从1:10至1:10 × 10的系列稀释液⁶ 在PBS中。使用多通道移液器将每个稀释度的5个重复点样至琼脂平板，以测定接种物的菌落形成单位（Colony-Forming Units，CFU）。此为接种前CFU。
6. 阴道预冲洗及接种 加德纳菌
   1. 在厌氧室中准备阴道灌洗/冲洗管。用移液器加入70 µ将无菌厌氧PBS加入已标记小鼠编号的1.5 mL微量离心管中。每只小鼠准备一个洗涤管。将管子盖紧后移出厌氧舱。
   2. 对每只小鼠用50 μL生理盐水进行阴道灌洗 µ从步骤2.1中制备的各个试管中收集厌氧PBS。这些阴道灌洗液为接种前的冲洗液，可用于后续的检测和分析。
      1. 第二次给药后 β-戊酸雌二醇注射液，将每只小鼠放置于笼盖或干净坚硬的表面上，使其前爪可以抓握。轻轻握住尾巴中段，将小鼠提起，使后躯略微抬高，暴露阴道开口。
      2. 使用移液器和P-200滤芯吸头吸取50 µ从对应小鼠的冲洗管中吸取50 μL PBS。将移液枪头轻轻插入阴道腔约2-3 mm处，并吸取50 µ轻轻吹打混合，3 到 4 次。
      3. 将收集的洗涤物（约50）转移 µL）将其吸回原先的洗涤管中，用移液枪在仍含有剩余20 μL洗涤液的管中上下吹打混匀 µPBS 溶液。如果黏液过多导致吸头堵塞，可使用新的 p200 吸头收集剩余物质，并放入同一洗涤管中。
   3. 经阴道给予 20 µ将50 μL浓缩细菌悬液或载体对照分别注入每只小鼠的阴道内。每只小鼠在完成阴道灌洗后应立即进行接种（即对每只小鼠依次完成灌洗和接种操作，再进行下一只小鼠）。为简化操作，建议使用两支p200移液器——其中一支预设体积为50 µ灌洗液的L及其他至20 µ用于接种的 L。
      1. 按照步骤 2.2.1 所述固定小鼠。使用 p-200 吸头，移取 20 µ将细菌悬液注入阴道。对于使用两种不同细菌物种/菌株的共接种实验，使用10 µ每种细菌悬液取 L，接种前避免两种菌株混合。
         注意： 总接种体积不应超过20 µL 以避免液体从阴道溢出。
      2. 继续托住每只小鼠的后肢约10–20秒，以防止给药液体立即积聚在阴道口。随后，将小鼠放入新笼子或与已完成接种的同笼小鼠放在一起。
      3. 对每只小鼠重复步骤2.2和步骤2.3。切勿将小鼠放回尚未接种的动物所在的笼子中。此举可防止小鼠在接种前意外接触链霉素耐药菌。
   4. 所有小鼠接种完成后，将接种液管重新放回厌氧室。按照步骤1.5所述方法，制备并涂布另一组系列稀释液。此为接种后菌落形成单位（CFU）。比较接种后与接种前平板的CFU，以确定接种液在动物接种过程中暴露于厌氧室外时其活力是否下降。
   5. 将步骤2.2中收集的阴道灌洗液接种于选择性琼脂平板（本实验中为含1 mg/mL链霉素的琼脂）。将平板置于37℃厌氧培养箱中孵育1–2天。 °C 并观察生长情况。注意：生长表明微生物组的内源性成员对筛选标记具有抗性，因此可能会干扰目标生物的菌落形成单位（CFU）计数。
7. 收集阴道灌洗液以确定活菌数 加德纳菌 定植
   1. 在选定的时间点收集阴道冲洗液，以分析阴道定植情况。收集方法同2.2步骤所述。
   2. 收集后立即放入阴道灌洗液至厌氧室。使用10 µ每份灌洗液取 L 进行连续稀释，并按步骤 1.5 所述接种至选择性琼脂平板。以菌落形成单位（CFU）计数作为阴道定植水平的衡量指标 加德纳菌 （或其他感兴趣的厌氧菌）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
β-雌二醇-17-戊酸酯	Sigma	E1631	小鼠的雌激素化
1× PBS	Fisher	MT21040CM	阴道灌洗， G. vaginlalis 接种物制备、组织采集与匀浆
厌氧培养箱	Coy	7200000	厌氧细菌的培养
Bacto 琼脂	Fisher	DF0140074	阴道加德纳菌，具核梭杆菌 和 P. bivia 琼脂平板
葡萄糖	Sigma	G7528	NYCIII 培养基用于 G. vaginalis 生长
HEPES	Cellgro	25-060-Cl	NYCIII 培养基用于 G. vaginalis 生长
马血清	止血钳	SHS500	NYCIII 培养基用于 G. vaginalis 生长
氢气混合气（5% 氢气，10% 二氧化碳，85% 氮气）	Matheson		厌氧培养箱用气体
Milli-Q 水纯化系统	Millipore	IQ-7000	用于培养基制备和匀浆
NaCl	Sigma	S3014	NYCIII 培养基用于 G. vaginalis 生长
氮气	Airgas		厌氧培养箱用气体
p-200 滤芯吸头	ISC Bio	P-1237-200	阴道灌洗和细菌接种
芝麻油	Fisher	ICN15662191	小鼠的雌激素化
分光光度计	BioChrom	80-3000-45	测量细菌的OD₆₀₀
链霉素	Gibco	11860038	加入琼脂培养基以制备选择性平板
酵母提取物	Fisher	DF0127-17-9	NYCIII 培养基用于 G. vaginalis 生长