利用显微注射将细菌定位于斑马鱼幼鱼肠道腔内的递送方法

摘要

来源：Li, J. et al. 建立幼年斑马鱼感染模型用于研究Clostridioides difficile。 J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了通过显微注射将荧光标记的Clostridioides difficile递送至麻醉斑马鱼幼体肠腔的方法。该方法概述了幼体准备、细菌注射以及基于荧光显微镜确认细菌在肠道内定位的各个步骤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 将染色的Clostridioides difficile注入斑马鱼幼鱼

1. 在注射前约10分钟，用含有0.02%–0.04%三卡因（将三卡因粉末溶于双蒸水中，并用1 M Tris-HCl溶液调节pH至7）的30% Danieau溶液对20–30条受精后5天（以下简称5 dpf）的斑马鱼幼鱼进行麻醉。将麻醉后的幼鱼转移至新的10 cm培养皿中，并去除多余的30% Danieau溶液。
2. 在斑马鱼幼鱼上滴加一滴0.8%低熔点琼脂糖，使其覆盖幼鱼。轻轻调整幼鱼至侧卧位置。将培养皿置于冰上30–60秒，使低熔点琼脂糖凝固。随后加入含0.02%–0.04%三卡因的30% Danieau溶液，覆盖琼脂糖。
3. 准备注射溶液。在9 µL染色的Clostridioides difficile接种液中加入1 µL 0.5%酚红磷酸盐缓冲液（PBS），以便观察注射过程。
4. 使用微量进样器将校准过的显微注射针头吸入注射溶液。将装有溶液的针头安装到显微操作仪上，并置于体视显微镜下定位。
5. 调节注射压力至600–900 hPa，设定注射时间为0.1–0.3秒，以获得0.5–1.0 nL的注射体积。将针头在显微操作仪上以约45°角对准包埋的幼鱼。
6. 将针尖置于消化道上方，靠近泌尿生殖孔处。用针尖穿透琼脂糖，继而穿过肌肉，插入肠腔内，注射0.5–1.0 nL的Clostridioides difficile。使用荧光显微镜监测注射后的幼鱼，并挑选成功注射的个体用于共聚焦成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低熔点琼脂糖	Pronadisa	8050	用于琼脂糖平板
BacLight 红色细菌染色剂	Thermo Fisher Scientific	B35001	荧光染料
玻璃毛细管	Harvard Apparatus	30-0019	注射针头
Clostridioides difficile			R20291，一种产毒素 TcdA+/TcdB+/CDT+ 的 027 型核糖体分型菌株
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	开源平台		图像处理
显微注射仪	eppendorf	5253000017
Leica SP8 共聚焦显微镜	Leica
酚红	Sigma-Aldrich	P0290
三卡因	Sigma-Aldrich	E10521