从幼年斑马鱼肠道中分离和培养Clostridioides difficile细菌

摘要

来源：Li, J., et. al.，建立幼年斑马鱼感染模型用于研究Clostridioides difficile。J. Vis. Exp.（2020）

本视频展示了从幼年斑马鱼肠道中分离和培养Clostridioides difficile细菌的方法。将感染的肠道组织解剖取出，匀浆后接种于含有抗生素的选择性厌氧培养基中进行培养。该培养条件可抑制其他微生物的生长，从而促进活菌细胞的增殖。

方案

分离幼年斑马鱼肠道以回收有活性的Clostridioides difficile

1. 分离幼虫的胃肠道以分析细菌载量。首先使用 0.4% 三卡因（tricaine）对斑马鱼幼虫实施安乐死。
2. 用无菌 1× PBS（磷酸盐缓冲液）短暂冲洗斑马鱼，并将其转移至新的琼脂糖培养皿中。
3. 斑马鱼解剖步骤
   1. 将一根针插入斑马鱼幼体头部附近的背部主干以固定斑马鱼，然后用采血针在鳃后方切除头部。
   2. 将第二根针插入背部主干的中部，第三根针插入斑马鱼的腹部，并将肠道从体腔中拉出。
      注意：分离完整肠道时需格外小心。若操作困难，可进行额外牵拉，以将剩余肠道与其他内脏器官完全分离。
   3. 使用显微注射针将 10–15 条肠道转移至含有 200 µL 无菌 1× PBS 的 1.5 mL 离心管中。
   4. 用研杵充分研磨肠道组织以制备匀浆液。确保研杵触及管底，以彻底破坏所有肠道组织。
4. 将匀浆液接种于含 D-环丝氨酸和头孢西丁的C. difficile培养基中，可选择性添加牛磺胆酸盐（TCA，C. difficile孢子的萌发诱导剂），并在厌氧培养箱中孵育。
5. 将培养皿置于 37 °C 厌氧条件下孵育 48 小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A2576	超低凝胶点琼脂糖
低熔点琼脂糖（LM）	Pronadisa	8050	用于制备琼脂糖平板
Clostridioides difficile			R20291，一种027型核糖体分型菌株，可产生TcdA+/TcdB+/CDT+
水平拉针仪	Sutter Instrument Inc	P-87
微量注射器	Eppendorf	5253000017
牛磺胆酸盐	Carl Roth GmbH	8149
三卡因	Sigma-Aldrich	E10521