通过微阵列筛选高通量鉴定抗细菌聚合物

摘要

来源：Venkateswaran, S., 等．用于医疗器械的抗细菌聚合物的高通量筛选．J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种高通量方法，通过将微阵列载玻片暴露于混合细菌培养物中，以鉴定抗细菌黏附的聚合物。细菌结合情况通过DAPI荧光进行评估，荧光信号降低表明该聚合物表面黏附细菌最少。

方案

1. 细菌接种至聚合物微阵列

注意：确保良好的无菌操作技术。所有培养物的操作均应在无菌环境中进行：可使用本生灯或在超净工作台中操作。培养物的培养应保证氧气供应，并根据各物种的具体需求调整培养基和温度。

1. 通过从平板上挑取单菌落接种至5 mL LB液体培养基（LB：10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 氯化钠，NaCl，和10 g/L 酵母提取物）中，制备过夜培养物。在37 °C、200 rpm（每分钟转数）振荡条件下过夜培养。
2. 向过夜培养物中加入甘油（终浓度为10%），制备冻存菌种，并将菌种保存于-80 °C。
3. 为确定解冻后细菌冻存液的细胞数量，对每种菌液进行系列稀释，并在固体培养基上过夜培养细菌。准确测定冻存液中的细胞数量可确保每种菌种接种量的准确性。
4. 为微阵列实验制备接种物。单一种类的细菌培养方法同上，可直接用于微阵列。BacMix-1 是由肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，K. pneumoniae）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus，S. saprophyticus）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）组成的细菌混合物。BacMix-2 是由变异链球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis，E. faecalis）组成的细菌混合物。
5. 为制备任一混合培养物，将各过夜培养物等体积混合（各3 mL），并用新鲜LB培养基稀释四倍（终体积约50 mL）。
6. 将经紫外线灭菌的聚合物微阵列置于矩形四孔板中，加入6 mL混合细菌培养物，在37 °C、轻度振荡（30 rpm）条件下孵育5天。
7. 孵育结束后，用磷酸盐缓冲液（PBS：137 mM NaCl，2.7 mM 氯化钾，KCl，10 mM 磷酸氢二钠，Na₂HPO₄，1.8 mM 磷酸二氢钾，KH₂PO₄）轻轻冲洗微阵列两次，随后在含1 µg/mL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色液的PBS中孵育30分钟。
8. 将染色后的微阵列玻片置于新的孔板中，用PBS覆盖并轻轻摇晃洗涤一次，更换PBS一次。在气流下干燥。将玻璃盖玻片覆盖于微阵列玻片上，并用胶水密封固定。待干燥后，用70%（v/v）乙醇对外表面进行灭菌处理。
9. 根据各菌种的生物安全等级，安全处置培养物。

2. 芯片成像与分析

1. 在明场和 DAPI（激发/发射波长，Ex/Em = 358 nm / 361 nm）通道中，分别对每种聚合物点样区域采集单张图像。使用荧光显微镜手动完成，或采用配备20倍物镜的自动荧光显微镜（带有由图像采集软件控制的X-Y-Z载物台）进行。
   注意：调节显微镜以使用明场和 DAPI 通道获取图像。确保所有微阵列图像采集时的增益和曝光时间保持一致。
2. 通过选定 DAPI 通道中每个点样的区域，并使用图像处理软件量化荧光强度，获得各点样的平均荧光强度。
3. 对于每个点样的背景荧光，获取仅用不含细菌的培养基孵育的重复微阵列上聚合物点样的图像。从点样信号强度中减去背景荧光，得到来源于细菌的荧光信号。
4. 计算代表每种聚合物的四个点样的平均归一化值，用于比较不同聚合物对细菌的结合能力。
5. 将表现出最少细菌结合（荧光强度最低）的聚合物确定为“命中”聚合物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅烷化处理载玻片	Sigma	S4651
聚合物	本实验室合成	不适用
LB肉汤培养基	Oxoid	CM1018
DAPI	Thermo Fisher	D1306
（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷包被的玻片	Sigma	Silane-prep
仪器设备
微阵列显微镜	IMSTAR	Pathfinder
共聚焦显微镜	Leica	SP5
图像分析软件	Media Cybernetics	Image-Pro Plus