从水样中分离耐药细菌用于分子分析

摘要

来源：Ghadigaonkar, D. 和 Rath, A. 水源性抗生素耐药细菌的分离与鉴定及其抗生素抗性基因的分子表征。J. Vis. Exp. (2023)

本视频演示了利用选择性培养基从水样中分离和培养耐药细菌的方法。从耐药细菌中提取DNA并进行扩增，以鉴定细菌的耐药基因。

方案

1. 样本采集与处理

1. 样品采集
   1. 在无菌采样容器中收集适量体积的水样，确保容器内液体不超过容器容积的3/4。
   2. 采集后应尽快在无菌条件下将样品运送至实验室，并立即进行处理。
2. 样品处理
   1. 将水样通过无菌纱布进行无菌过滤，以去除任何颗粒物。
   2. 对过滤后的水样进行适当的连续稀释，用于后续分析。

2. 总细菌负荷及耐药细菌数量的估算

1. 总细菌负荷的测定
   1. 将18.12 g改良型R2A琼脂（Reasoner's 2A琼脂）粉末溶于1,000 mL双蒸水中，加热溶解。在121 °C、15 psi条件下高压灭菌20分钟。通过将适量灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中制备改良型R2A琼脂平板（例如，向一个90 mm无菌培养皿中加入约20 mL灭菌后的培养基）。
   2. 待培养基凝固后，取100 µL适当稀释度的滤过水样均匀涂布于改良型R2A琼脂平板上。实验设两个重复。
   3. 将上述所有平板在35 - 37 °C下培养48小时（根据所用培养基的不同，可调整培养温度和时间）。
   4. 使用公式（1）以每毫升菌落形成单位（CFU/mL）表示总细菌负荷：
2. 抗生素耐药菌数量的测定
   1. 按照步骤2.1.1–2.1.4操作，但使用分别添加了五种不同抗生素的改良型R2A琼脂平板，即头孢噻肟（3 µg/mL）、环丙沙星（0.5 µg/mL）、红霉素（20 µg/mL）、卡那霉素（15 µg/mL）和万古霉素（3 µg/mL）。
   2. 将抗生素分别加入含有20 mL无菌熔融状态改良型R2A琼脂的试管中（熔融改良型R2A琼脂的温度应≤40 °C），使最终抗生素浓度达到步骤2.2.1中所述水平。
   3. 轻轻旋转混匀，在琼脂凝固前倒入无菌培养皿中。实验设两个重复。
   4. 将上述所有平板在35 - 37 °C下培养48小时（若使用其他培养基，培养温度和时间可能有所不同）。
   5. 为进行质量控制并检测抗生素的有效性，将100 µL大肠杆菌Escherichia coli ATCC 25922和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213菌悬液分别涂布于含有相应抗生素的改良型R2A琼脂平板上（确保接种用新鲜培养物的密度为在600 nm处的光密度OD = 0.5）。
   6. 按照步骤2.1.4所述方法，以CFU/mL为单位确定抗生素耐药菌的数量。

通过16S核糖体RNA（rRNA）基因测序鉴定可培养细菌

1. 从分离物中制备用于聚合酶链式反应（PCR）的DNA模板
   1. 使用无菌牙签挑取培养在培养皿上的单个、孤立且纯的分离物菌落。将细菌菌落悬浮于装有100 µL无菌双蒸水的无菌微量离心管中，煮沸10分钟。
   2. 将悬浮液在10,000 × g 条件下离心2分钟，使细胞碎片沉淀，然后将上清液转移至新的无菌微量离心管中，作为粗制DNA模板使用。
2. 16S rRNA基因V3区的靶向PCR扩增及测序
   1. 在PCR管中配制40 µL反应体系进行PCR扩增，具体组分见表1。
      注意：DNA制备过程应在冰上操作，尽量减少污染风险（操作试剂时应戴手套，并用70%乙醇彻底清洁工作台面）。
   2. 将PCR管放入热循环仪的加热块中，运行相应的程序。16S rRNA基因V3区扩增所用的标准PCR循环条件及引物信息详见表2。

表1：PCR预混液的组分。 各种PCR试剂的反应混合物体积组成。

PCR 试剂	体积 (μL)
2x Taq Master Mix	20
正向引物 (10 pico mole)	1.5
反向引物 (10 pico mole)	1.5
粗提 DNA 模板	1.5
无菌分子生物学用水	15.5
总体积	40

表2：扩增16S rRNA基因的PCR循环条件。 显示了扩增16S rRNA基因所需的PCR循环条件。步骤包括初始变性步骤，随后进行35个循环的变性、退火和延伸，以及最终的延伸步骤。

方向	引物序列 5’ – 3’	PCR 条件	循环次数
正向	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94 °C 预变性 10 分钟	1
		变性：94 °C，30 秒	35
		退火：50 °C，30 秒
		延伸：72 °C，40 秒
反向	CTACCGGGGTATCTAATCC	最终延伸：72 °C，5 分钟	1

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2x PCR Taq 预混液	HiMedia	MBT061-50R	用于配制 PCR 反应体系
37 °C 培养箱	GS-192, Gayatri Scientific	NA	用于细菌培养
高压灭菌器	Equitron	NA	用于培养基、玻璃器皿、试管等物品的灭菌
生物安全二级 B2 型柜	IMSET	IMSET BSC-Class II Type B2	用于细菌培养、药敏试验（AST）等微生物学操作
头孢噻肟抗生素粉末	HiMedia	TC352-5G	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
小型离心机	Eppendorf	Minispin Plus-5453	用于粗提 DNA 过程中沉淀杂质
环丙沙星抗生素粉末	HiMedia	TC447-5G	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
比色计	Quest	NA	用于测定菌液悬浮液的光密度（OD）
冷却振荡培养箱	BTL41 Allied Scientific	NA	用于培养细菌的培养基平板培养
红霉素抗生素粉末	HiMedia	CMS528-1G	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
红霉素抗生素粉末	HiMedia	TC024-5G	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
卡那霉素抗生素粉末	HiMedia	MB105-5G	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
LB 肉汤培养基（Luria Bertani broth）	Himedia	M1245-500G	用于菌种富集培养
改良 R2A 琼脂	HiMedia	M1743	用于制备培养基平板，以分离总菌群及抗生素耐药菌（AR）
氯化钠	HiMedia	TC046-500G	用于配制 0.85% 生理盐水，对水样进行系列稀释
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213	HiMedia	0365P	进行药敏试验（AST）时作为对照菌株
万古霉素抗生素粉末	HiMedia	CMS217	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
电子天平	Mettler Toledo	ME204 Mettler Toledo	用于称量培养基粉末、试剂粉末等