一种用于研究植物宿主与互作细菌分子响应的共培养系统

摘要

来源：Nathoo, N.，等．一种用于植物/微生物分子互作与信号传导同步系统分析的水培共培养系统．J. Vis. Exp. （2017）。

本视频展示了一种用于在无菌条件下研究植物–细菌相互作用的水培共培养系统。将植物幼苗转移至无菌的酸性生长培养基中，孵育并检查污染情况，然后接种农杆菌（Agrobacterium）。活化的细菌附着于植物根部，将T-DNA转入植物细胞，促进分子变化，从而增强细菌定植能力。

方案

1. 水培共培养系统

1. 配制液体Murashige和Skoog（MS）培养基：每升含MS基础盐2.165 g、蔗糖10 g、2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）0.25 g、B5维生素混合液59 mL，pH调至5.75。
2. 将培养基高压灭菌。在无菌条件下，将18 mL培养基倒入每个带有无菌盖的无菌圆柱形玻璃或透明塑料容器（结晶皿，100 × 80 mm²）中。
   注意：通过用铝箔包裹容器及盖子并进行高压灭菌，预先对其进行灭菌处理。
3. 在无菌操作台中，使用无菌镊子将带有10–14天龄幼苗的每块网格膜从半固体培养基小心转移至水培圆柱形容器中（图1d）。用透气的外科胶带密封容器盖。
4. 将幼苗在容器中的网格膜上于22–24 °C条件下培养72小时，光照周期为16小时光照，同时以50 rpm振荡通气（图1e）。
   注意：此步骤使植物在接种（共培养）微生物前适应水培环境。该等待期也有助于在接种前发现可能的微生物污染。
   1. 在培养期结束的前一天开始下一步操作。
5. 在农杆菌（AB）培养基（0.5% w/v酵母提取物、0.5% w/v胰蛋白胨、0.5% w/v蔗糖、50 mM MgSO₄，pH 7.0）中，于28 °C振荡培养Agrobacterium tumefaciens过夜，直至菌液在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到1.0（以未接种的AB培养基作为空白对照，使用分光光度计测定）。
   注意：OD₆₀₀为1.0时，相当于约10⁹个细胞/mL。
6. 用等体积的0.85% NaCl洗涤A. tumefaciens三次，然后重悬于等体积的无菌双蒸水中。
7. 接种前，仔细检查装有幼苗的容器，确保无污染；未受污染容器中的培养基应清澈透明。
   1. 弃去液体浑浊的容器（已被污染），并对其余容器编号。从每个编号容器中取少量（20 µL）水培培养基样品，点样于盛有LB培养基的培养皿中。将培养皿在28 °C下培养。
8. 立即向每个编号的水培容器中加入50 µL A. tumefaciens菌悬液（根据OD₆₀₀估算，约含5 × 10⁷个细胞）。将Arabidopsis thaliana幼苗与A. tumefaciens在22–24 °C、16小时光照周期、50 rpm振荡条件下共培养（图3f）。
   1. 在接种后12小时和28小时检查步骤1.7.1中点样的LB平板，以确认容器的无菌状态。若发现污染，则不得将对应编号的容器（已接种细菌）用于后续实验分析。
9. 如需监测，可定期从容器中取样培养基，使用分光光度计测定OD₆₀₀（以未接种的对照培养基为空白），从而跟踪A. tumefaciens的生长情况（图2）。
   注意：植物病害症状通常在7天后显现（图3）。

结果

图1：水培植物-微生物共培养系统。 左侧面板展示了组装和运行水培共培养系统的六个关键步骤的流程图。右侧面板展示了研究拟南芥-农杆菌相互作用时，水培共培养系统所用的实际实验材料、设备及操作流程。接种步骤以及最终的植物或细菌取样步骤未在此展示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
植物种子（Arabidopsis thaliana Col-0）	拟南芥生物资源中心	CS7000	https://abrc.osu.edu/order-stocks
细菌（Agrobacterium tumefaciens C58）	华盛顿大学	N/A
标记细菌	实验室自制		可选，取决于下游分析
双蒸水	（多种）
微量移液器	（多种）
Murashige 和 Skoog（MS）基础盐	Sigma-Aldrich	M5524
蔗糖	（多种）
MES	（多种）
B5 维生素混合物	Sigma-Aldrich	G1019
植物琼脂	（多种）
深型培养皿	（多种）
不锈钢网筛	费里尔金属制品有限公司	N/A	等级：304；网目数：40 × 40；丝径：0.01
微孔胶带，1英寸	3M	1530-1
昼夜生长箱	（多种）
圆柱形玻璃罐，100 × 80 mm	Pyrex	3250	可使用其他尺寸，此时液体含量可能需要调整
超净工作台	（多种）
镊子	（多种）
酵母提取物	（多种）
胰蛋白胨	（多种）
MgSO₄	（多种）
摇床培养箱	（多种）