本文展示了一种用于活细胞染色的实验方案，可方便地检测气味受体在HEK293T细胞表面的表达。此外，该方法也可用于检测其他化学感受受体或G蛋白偶联受体（GPCRs）在细胞表面的表达。
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本文内容
摘要
摘要
气味的丰富世界由嗅觉感知。小鼠的嗅觉由约1200种G蛋白偶联受体（GPCRs）1介导，这些受体被假定可结合挥发性气味分子，并通过与G蛋白Gαolf偶联，将胞外信号转化为胞内信号。气味分子与受体的结合被认为遵循组合编码原则，即一种气味分子可结合多个受体，而一个受体也可不同程度地结合多种气味分子2。对于大多数GPCRs，利用异源细胞已可方便地开展生化、信号转导及配体结合研究。然而，长期以来，异源细胞无法用于气味受体的研究，因为转染后这些受体无法有效转运至细胞表面。Saito等人已证明，单次跨膜的受体转运蛋白（Receptor Transporting Protein, RTP）家族分子伴侣在嗅觉感觉神经元中高表达，当与气味受体共转染时，可在异源细胞中促进气味受体向细胞表面的转运3。为了在异源细胞中开展受体的生化检测，首先必须确定该受体在细胞系中是否具有较强的表面表达。这可通过共过表达受体与分子伴侣RTP1S，随后进行活细胞染色，特异性地标记受体的胞外结构域或位于胞外结构域的标签，实现荧光检测。本文展示了一种可用于便捷检测HEK293T细胞表面气味受体的活细胞染色实验方案。此外，该方法也可用于其他化学感受受体或GPCRs表面表达的检测。
方案
1. 实验步骤：
该实验流程共需3天完成，分为三个步骤：细胞转移、转染和免疫细胞化学，每天进行一步。前两天的细胞转移和转染操作必须在超净台内的无菌条件下进行。
第1天：转移HEK293T细胞用于表面表达检测。
- 转移培养基（M10）：在无菌条件下，将最低必需培养基与10%（体积比）胎牛血清混合。
- 在100 mm培养皿中将细胞培养至所需汇合度，具体取决于需要准备的培养皿数量。确定待转移细胞的比例至关重要，以避免细胞过度生长或过于稀疏：例如，从一个100%汇合的100 mm培养皿中，可将约3%的细胞转移至35 mm培养皿，以获得后者约30%的汇合度。
- 在细胞转移前，于无菌超净工作台内，用无菌多聚赖氨酸（1 mg/mL）包被22 × 22 mm的玻璃盖玻片，并将每张盖玻片有包被面朝上放入各35 mm细胞培养皿中用于接种细胞（图1）。让溶液干燥5–10分钟。在此期间，可根据需要开启超净台内的紫外光源对盖玻片进行灭菌。多聚赖氨酸有助于异源细胞黏附于盖玻片表面。
- 转移细胞时，吸除100 mm培养皿中的原有培养基，小心加入8 mL无菌PBS洗涤，随后吸除PBS，并加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA进行消化；当细胞从皿底脱落时，加入5 mL M10以终止酶反应。吹打混悬细胞，并将所需体积转移至无菌锥形管中，在200×g离心5分钟以沉淀细胞。吸除含有胰蛋白酶-EDTA的上清液，保留细胞沉淀。为将细胞接种至35 mm培养皿，每皿加入1 mL M10，吹打重悬以充分分散细胞，然后向每皿加入1 mL重悬细胞液。于37°C、5% CO2条件下过夜培养。
图1. 用多聚赖氨酸包被22 × 22 mm玻璃盖玻片，并将每张有包被面朝上放入各35 mm培养皿中。
第2天：转染HEK293T细胞。
- 转移后18-24小时，细胞即可用于待检测受体的转染。使用克隆于哺乳动物表达载体pCI中的受体和RTP1S，通过Qiagen Miniprep Kit从细菌培养物中提取，具体操作参照之前描述的方案4。使用N端带有20个氨基酸长视紫红质表位标签的受体，以利于免疫染色。
- 每次转染使用1000 ng受体构建体、250 ng RTP1S构建体和50 ng绿色荧光蛋白。按照生产商说明书，使用Lipofectamine 2000进行转染。
第3天：免疫细胞化学染色以可视化细胞表面标记的受体。
- 开始前，配制染色和洗涤溶液，并将其冷却至 4°C。染色液：最低必需培养基（Minimum Essential Medium），45 mL；胎牛血清（Fetal Bovine Serum），5 mL；HEPES（1M），500 μL（终浓度 10 mM）；叠氮化钠（Sodium Azide）（1.5M），500 μL（终浓度 15 mM）。洗涤液：HBSS，500 mL；HEPES（1M），5 mL（终浓度 10 mM）；叠氮化钠（Sodium Azide）（1.5M），5 mL（终浓度 15 mM）。上述两种溶液均可在 4°C 保存以供重复使用。将所需抗体用染色液稀释 100 倍，配制抗体溶液。
- 转染后约 24 小时开始进行气味受体的表面染色免疫化学实验。进行活细胞染色时，实验装置必须冷却至 4°C：准备一个较大的容器装满冰，并将冰面拍平以尽可能使其均匀；将一个托盘置于冰上，并用 70% 乙醇喷洒托盘表面。裁剪一块略小于托盘长度的 Parafilm 膜，将其贴附于已喷洒乙醇的托盘表面，以获得光滑的操作平面。使用镊子逐个将含有转染细胞的玻璃盖玻片转移至 Parafilm 膜上，细胞面朝上。从盖玻片的一角小心地加入 100 μL 冷的初级染色液，使其覆盖整个盖玻片表面（图 2）。待所有盖玻片均覆盖抗体溶液后，盖上托盘以防止溶液在空气中干燥。在 4°C 下孵育 45–60 分钟。
- 初级孵育结束后，迅速将盖玻片转移回原 35 mm 培养皿中（内含培养基）。吸除培养基，从培养皿边缘轻轻加入 2 mL 预冷的洗涤液，避免因冲洗导致盖玻片上的细胞脱落。吸除洗涤液，重复此步骤两次，共完成三次洗涤。第三次洗涤结束后，保留洗涤液，不要吸除。
- 在染色液中配制二抗溶液，将盖玻片从洗涤液中转移至同一托盘中新贴附的 Parafilm 膜上。如同初级孵育步骤，从盖玻片一角小心地加入 100 μL 二抗溶液，使其均匀覆盖每个盖玻片。在 4°C 下孵育 30–45 分钟后，将盖玻片重新转移回原 35 mm 培养皿中的洗涤液中。再次按照前述方法清洗盖玻片三次。
- 最后一次洗涤后吸除洗涤液，加入 2 mL 预冷的 1% 甲醛溶液。将细胞在冰上用预冷的 1% 甲醛溶液固定 15 分钟。
- 使用封片剂 Mowiol 将盖玻片细胞面朝下封固于洁净的显微镜载玻片上，操作时需谨慎排除所有气泡（图 3）。待 Mowiol 表面干燥后，通过在表面滴加蒸馏水并立即吸除的方式轻轻清洗盖玻片。
图 2. 每个盖玻片上覆盖 100 μL 冷的初级染色液。
图 3. 使用 Mowiol 封片剂将盖玻片细胞面朝下封固于洁净的玻璃显微镜载玻片上。
2. 典型结果：
活细胞染色可实现对细胞表面蛋白的可视化观察，例如在共转染受体与分子伴侣时（本例中为气味受体 Olfr62 与受体转运蛋白 RTP1S）（图 4）。受体的细胞表面染色表现为点状染色模式（图 4B，插图）。若染色操作不当，可能导致背景噪声升高，使观察者难以区分真实的表面染色信号与噪声。
图 4. 受体与分子伴侣共转染后，可通过活细胞染色实现细胞表面蛋白的可视化。单独转染气味受体 Olfr62（A），以及共转染 Olfr62 与 RTP1S 分子伴侣（B）。GFP 表达水平用作转染对照（A' 和 B'）。
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讨论
每一步操作都必须谨慎进行，以确保获得明显且特异的表面染色效果。整个染色过程必须在低温（冰上）进行，放置盖玻片的托盘在使用前必须预先冷却，以确保细胞保持存活状态。此外，固定步骤是在表面染色过程结束后进行的。这一点与胞内染色有显著区别：在胞内染色中，固定需在染色前完成，以便使细胞膜通透，利于一抗和二抗进入细胞。必须尽量减少盖玻片暴露于空气中的时间，防止细胞干燥；因此，在处理多个盖玻片时，向盖玻片上添加抗体溶液、将盖玻片转移至洗涤液、以及更换洗涤液等操作都应迅速完成，并逐一进行。
根据所使用的表位标签和抗体，可能需要调整孵育时间、洗涤次数以及抗体的稀释倍数。通过增加抗体稀释倍数、增加洗涤次数或缩短孵育时间，可以避免背景噪声。
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致谢
感谢Matsunami实验室成员对本文手稿的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盖玻片 22 × 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| 胎牛血清 | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| 最低必需培养基 | Sigma-Aldrich | M4655 | 含 L-谷氨酸、Earle’s 盐和碳酸氢盐 |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| 多聚甲醛 | EMS | 19208 | |
| 汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 1× | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 含氯化钙和氯化镁 |
| HEPES 缓冲液 | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | 不含钙和镁 |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| 叠氮化钠 | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| 组织培养皿 35 × 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
参考文献
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
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