E. coli 原生质球的制备

摘要

来源：Figueroa, D. M., 等. 抗菌肽定位表征中细菌球状体与原生质体的制备与可视化。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了通过首先抑制大肠杆菌（Escherichia coli）细胞分裂以诱导丝状化，随后进行细胞壁的酶解，从而制备大肠杆菌球状体的方法。该过程包括可控地添加螯合剂、DNase 和渗透压稳定剂，以确保球状体的正常形成及其在显微镜观察中的稳定性。

方案

1. 溶液配制

1. 在125 mL锥形瓶中，将10.34 g Tris HCl和4.17 g Tris OH溶于50 mL去离子水（dH₂O）中，配制pH 7.8的1 M Tris-Cl溶液。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，转移至锥形管中，室温保存。
2. 在125 mL锥形瓶中，将0.10 g MgCl₂（95.2 g/mol）和11.98 g蔗糖（342.3 g/mol）溶于25 mL去离子水（dH₂O）中，配制溶液A（20 mM MgCl₂、0.7 M蔗糖、10 mM Tris-Cl，pH 7.8）。加入500 µL 1 M Tris-Cl（pH 7.8），定容至50 mL。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，转移至锥形管中，室温保存。
3. 在125 mL锥形瓶中，将0.05 g MgCl₂（95.2 g/mol）和13.69 g蔗糖（342.3 g/mol）溶于25 mL去离子水（dH₂O）中，配制溶液B（10 mM MgCl₂、0.8 M蔗糖、10 mM Tris-Cl，pH 7.8）。加入500 µL 1 M Tris-Cl（pH 7.8），定容至50 mL。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，转移至锥形管中，室温保存。
4. 在125 mL锥形瓶中，将13.69 g蔗糖（342.3 g/mol）溶于50 mL去离子水（dH₂O）中，配制0.8 M蔗糖溶液。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，转移至锥形管中，室温保存。
5. 在50 mL锥形瓶中，将0.015 g脱氧核糖核酸酶I（DNase I）溶于3 mL去离子水（dH₂O）中，配制5 mg/mL DNase I溶液。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌。将溶液分装至微量离心管中，于-20 °C保存。
6. 在125 mL锥形瓶中，将0.698 g乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA disodium dehydrate，372.2 g/mol）溶于15 mL去离子水（dH₂O）中，配制pH 8.0的0.125 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，转移至锥形管中，室温保存。
7. 在125 mL锥形瓶中，将0.03 g头孢氨苄水合物（cephalexin hydrate，365.404 g/mol）溶于50 mL去离子水（dH₂O）中，配制600 µg/mL头孢氨苄溶液。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，转移至锥形管中，4 °C保存。
8. 在50 mL锥形瓶中，将0.015 g溶菌酶（lysozyme）溶于3 mL去离子水（dH₂O）中，配制5 mg/mL溶菌酶溶液。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌。将溶液分装至微量离心管中，于-20 °C保存。
9. 在2 L锥形瓶中，将30 g胰蛋白胨大豆肉汤（Trypticase Soy Broth, TSB）溶于1 L去离子水（dH₂O）中，配制3% w/v TSB培养基。将溶液分装至若干锥形瓶中，每瓶含25 mL或100 mL TSB，用于大肠杆菌（E. coli）球状体的制备。通过高压灭菌对锥形瓶进行灭菌处理。灭菌后的TSB可在室温或4 °C保存。

2. 过夜培养物的制备

注意： 使用适当的无菌技术执行第2-3节。如需要，可使用含有抗生素抗性质粒的菌株，以减少潜在的污染。若使用具有抗生素抗性的菌株，请在步骤2.1和3.1–3.2中加入相应的抗生素。

1. 使用无菌移液枪头挑取单个细菌菌落，接种于含有2–3 mL 3% w/v TSB的14 mL培养管中，制备过夜培养物。在37 °C条件下振荡培养16–21 h。

3. 革兰氏阴性 E. coli 原生质球的制备

1. 在250 mL锥形瓶中，将过夜培养物按1:100比例接种于25 mL含3% w/v TSB的培养基中，于37 °C振荡培养约2.5 h，直至菌液在600 nm处的光密度达到0.5–0.8。使用分光光度计测定光密度。
2. 在250 mL锥形瓶中，将该培养物按1:10比例稀释于30 mL 3% w/v TSB中，加入终浓度为60 µg/mL的头孢氨苄（347.4 g/mol），于37 °C振荡培养2.5 h，以获得长度约为50–150 µm的单细胞丝状体，可在光学显微镜下以1,000倍放大观察图1B).
3. 通过在 1,500 x g 条件下离心菌液收集菌丝 g4 °C 下离心 4 分钟。倾去上清液并弃去，保留沉淀。
4. 轻轻加入1 mL 0.8 M蔗糖溶液洗涤丝状物，注意不要扰动沉淀。孵育1分钟，然后在不扰动沉淀的情况下弃去上清液。
5. 向沉淀中依次加入 150 µL 1 M Tris-Cl（pH 7.8）、120 µL 5 mg/mL 溶菌酶、30 µL 5 mg/mL DNase I 和 120 µL 0.125 M EDTA，室温孵育 10 分钟。
6. 使用移液器在1分钟内将1 mL溶液A缓慢加入3.5步骤中制备的溶液中，同时用手轻轻摇动溶液。室温孵育4分钟。
7. 将7 mL的4 °C溶液B加入两个15 mL圆锥形离心管中。将3.6步骤中制备的溶液等量加入这两个离心管中。在1,500 x g，4 °C 下 4 分钟。
8. 使用血清移液管，小心吸出除1以外的全部液体-2 mL上清液，注意不要扰动沉淀。使用P1000移液器轻轻吹打沉淀，使其重悬。在光学显微镜下以1,000倍放大观察样品，目视检查球状体的形成情况图1C).
9. 将原生质球在 -20 °C 保存一周，或直至完成 3 次冻融循环。

结果

图1：代表性图像 E. coli. (A) E. coli 细菌（B) E. coli 蛇和（C) E. coli 原...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris HCl）	Sigma	T3253
三羟甲基氨基甲烷碱（Tris OH）	Sigma	T1503
氯化镁	Sigma	M8266
蔗糖	Sigma	S7903
溶菌酶	Sigma	L6876
脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	D4527
乙二胺四乙酸	Sigma	106361	原始方案开发中使用 Sigma 106361；该货号已停售，由 ED2SS 替代
头孢氨苄水合物	Sigma	C4895
BBL 胰蛋白胨大豆肉汤	Fisher Scientific	B11768
Acrodisc 25 mm 注射器滤器，带 0.2 μm HT Tuffryn 膜	Pall Corporation	4192