从革兰氏阳性菌巨型芽孢杆菌中生成原生质体

摘要

资料来源： Figueroa， D. M. 等人。 细菌球体和原生质体的生产和可视化，以表征抗菌肽的定位。 J. Vis. Exp. （2018年）

该视频演示了从革兰氏阳性菌巨型芽孢杆菌生成原生质体的分步过程。

方案

1. 溶液制备

1. 通过将 0.015 g 溶菌酶溶解在 50 mL 烧瓶中的 3 mL dH₂O 中来制备 5 mg/mL 溶菌酶。通过带有 0.2 μm 膜的 25 mm 注射器过滤器过滤进行灭菌。将溶液等分到微量离心管中并储存在-20°C。
2. 通过将 30 g TSB 溶解在 2 L 烧瓶中的 1 L dH₂O 中，制备 3% w/v 胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB）。将溶液等分到含有 100 mL TSB 的烧瓶中，用于制备 B. megaterium 原生质体。高压灭菌瓶对液体介质进行灭菌。无菌 TSB 可以在室温或 4 °C 下储存。
3. 通过将 34.23 g 蔗糖 （342.3 g/mol）、0.46 g 马来酸 （116.07 g/mol） 和 0.38 g MgCl₂ （95.21 g/mol） 溶解在 250 mL 烧瓶中的 100 mL dH₂O 中，制备溶液 C（1 M 蔗糖，0.04 M 马来酸盐，0.04 M MgCl_{2，pH 6.5}）。将 pH 值调节至 6.5。通过带有0.2μm膜的25mm注射器过滤器过滤进行灭菌，并在室温下储存在锥形管中。
4. 通过在 1 L 玻璃瓶中混合 100 mL 3% w/v TSB 和 100 mL 溶液 C 来制备 200 mL 原生质体培养基。高压灭菌器对溶液进行灭菌并在室温下储存。

2. 革兰氏阳性巨型芽孢杆菌原生质体的制备

1. 在 250 mL 烧瓶中，将过夜培养物在 100 mL 的 3% w/v TSB 中以 1：1,000 稀释，并将细菌溶液在 37 °C 下孵育，同时摇动约 4.5 小时，直到溶液在 600 nm 处达到 0.9-1.0 的光密度。使用分光光度计测量光密度。
2. 将液体培养物倒入两个 50 mL 锥形管中，并在 2,000 x g、4°C 下离心 10 分钟。
3. 使用血清移液器，从两个锥形管中丢弃上清液。将每个沉淀重悬于 2.5 mL 原生质体培养基中，并将重悬的溶液混合到单个锥形管中。将组合的重悬溶液移液到125mL烧瓶中。
4. 加入 1 mL 5 mg/mL 溶菌酶，在 37°C 下孵育 1 小时，同时摇动。
5. 使用光学显微镜在 1,000 倍放大倍率下监测原生质体的生长，注意任何不规则之处，例如细菌表现为肿胀的棒状物而不是球体（图 1）。使用血清移液器，将溶液转移到 15 mL 锥形管中，并在 2,000 x g、4°C 下离心 10 分钟。
6. 倒出上清液并将沉淀重新悬浮在 5 mL 原生质体培养基中。将原生质体在-20°C下储存长达一周，或直到它们经历3个冻融循环。

结果

图 1：B. megaterium 的代表性图像。（A） B. megaterium 细菌和 （B） B. megaterium 原生质体。图像以 100 倍放大倍率拍摄

材料