从革兰氏阳性菌 Bacillus megaterium 制备原生质体

摘要

来源： Figueroa, D. M., et al. 抗菌肽定位表征中细菌球状体与原生质体的制备与可视化。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了从革兰氏阳性菌Bacillus megaterium制备原生质体的逐步操作流程。

方案

1. 溶液配制

1. 在50 mL烧瓶中，将0.015 g溶菌酶溶解于3 mL去离子水（dH₂O）中，配制成5 mg/mL的溶菌酶溶液。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌。将溶液分装至微量离心管中，于-20 °C保存。
2. 在2 L烧瓶中，将30 g胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）溶解于1 L去离子水（dH₂O）中，配制成3% w/v TSB溶液。将溶液分装至若干烧瓶中，每瓶含100 mL TSB，用于后续巨大芽孢杆菌（B. megaterium）原生质体制备。通过高压灭菌对烧瓶进行灭菌处理。灭菌后的TSB可在室温或4 °C保存。
3. 在250 mL烧瓶中，将34.23 g蔗糖（342.3 g/mol）、0.46 g马来酸（116.07 g/mol）和0.38 g MgCl₂（95.21 g/mol）溶解于100 mL去离子水（dH₂O）中，配制溶液C（1 M蔗糖，0.04 M马来酸盐，0.04 M MgCl₂，pH 6.5）。调节pH至6.5。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，并将溶液储存于锥形管中，室温保存。
4. 在1 L玻璃瓶中，将100 mL 3% w/v TSB与100 mL溶液C混合，配制成200 mL原生质体培养基。高压灭菌以灭菌溶液，室温保存。

2. 革兰氏阳性 B. megaterium 原生质体制备

1. 在250 mL锥形瓶中，将过夜培养物按1:1,000比例稀释于100 mL含3% w/v TSB的培养基中，于37 °C振荡培养约4.5小时，直至菌液在600 nm处的光密度达到0.9–1.0。使用分光光度计测定光密度。
2. 将液体培养物倒入两个50 mL离心管中，于4 °C、2,000 x g 离心10分钟。
3. 使用移液管弃去两个离心管中的上清液。将每份沉淀重悬于2.5 mL原生质体培养基中，并将重悬液合并至一个50 mL离心管中。用移液管将合并后的重悬液转移至125 mL锥形瓶中。
4. 加入1 mL浓度为5 mg/mL的溶菌酶溶液，于37 °C振荡孵育1小时。
5. 在1,000倍光学显微镜下观察原生质体生长情况，注意是否存在异常形态，例如细菌呈膨胀杆状而非球形（图1）。使用移液管将溶液转移至15 mL离心管中，于4 °C、2,000 x g 离心10分钟。
6. 倾去上清液，将沉淀重悬于5 mL原生质体培养基中。将原生质体于-20 °C保存，可保存至多一周，或直至经历三次冻融循环。

结果

图1：代表性图像 B. megaterium. (A) B. megaterium 细菌和（B) B. megaterium 原生质体。图像在100倍放大...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化镁	Sigma	M8266
蔗糖	Sigma	S7903
溶菌酶	Sigma	L6876
BBL 胰蛋白胨大豆肉汤	Fisher Scientific	B11768
马来酸	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm 注射器滤器，带 0.2 μm HT Tuffryn 膜	Pall Corporation	4192