评估转胞吞作用 E. coli 跨肠上皮单层

摘要

来源： Islam, A., 等人， 新生儿肠道转胞吞作用的评估 大肠杆菌 菌血症分离株 视频实验杂志 (2023)

本视频演示了评估新生期跨细胞转运的实验步骤 大肠杆菌 使用Transwell小室、电阻测量和细菌定量法检测跨肠上皮单层的通透性。

方案

1. 细胞接种（实验开始）

1. 准确培养2小时后，从摇床中取出早晨的细菌培养物，在4 °C条件下以1,900 × g 离心10分钟。
   注意：后续所有步骤中，均需将细菌悬液置于冰上，以最大限度抑制细菌生长。
2. 将细菌沉淀用不含抗生素的组织培养基（TCM）重悬。使用分光光度计将光密度（OD）调整至0.7–0.9，并进一步用不含抗生素的TCM稀释至浓度为1 × 10⁶ 菌落形成单位（CFU）/mL（约1:100稀释）。用此细菌悬液以每插入物100 µL含1 × 10⁵ CFU的量感染各插入物。
3. 标记Transwell板，并向每个插入物中加入100 µL经OD调整的接种液（每插入物共1 × 10⁵ CFU）。此时实验正式开始。记录时间并记为t = 0 h。
4. 对接种用的细菌悬液进行平板接种，采用梯度稀释法定量CFU/mL，将10 µL等分试样点种于方形LB琼脂平板上。

2. 转胞吞作用的定量分析

1. 接种后每隔30分钟，用500 µL不含抗生素的TCM填充新孔，并使用不同的无菌镊子将每个不同细菌菌株的插入物转移至这些新孔中。
2. 将每个插入物所用收集孔中的培养基分别收集到已标记的离心管中，并将这些离心管置于冰上。在各时间点之间，将Transwell板放回培养箱中。
3. 对于每个插入物，合并t = 0.5 h、t = 1 h、t = 1.5 h和t = 2 h时收集的培养基，短暂涡旋混匀。采用轨迹稀释法将合并后的收集培养基接种至Luria-Bertani（LB）琼脂平板，以定量实验最初2小时内发生转胞吞的细菌量。
   注意：每30分钟收集一次细菌并置于冰上，可最大限度减少收集孔中细菌的生长，从而确保检测结果主要反映的是转胞吞细菌的数量。
4. 将标记好的轨迹稀释LB琼脂平板置于37 °C细菌培养箱中培养，无需额外添加CO₂，同时将T84 Transwell板放回组织培养箱中。
5. 在t = 4 h时，重复步骤2.3，合并t = 2.5 h、t = 3 h、t = 3.5 h和t = 4 h时收集的培养基进行分析。
6. 在t = 6 h时，重复步骤2.3，合并t = 4.5 h、t = 5 h、t = 5.5 h和t = 6 h时收集的培养基进行分析。此外，在t = 6 h时，对对照孔的培养基进行平板接种。

3. 实验结束

1. 在实验结束时（t = 6 h）测量并记录跨上皮电阻（TEER）。
2. 将探针浸入70%乙醇中10–15分钟以去污染。根据需要，弃去或保存/处理Transwell小室用于其他应用。将LB琼脂平板过夜培养，并对所有其他使用过的材料进行消毒和/或安全处理。
3. 过夜培养后，手动计数梯度稀释LB平板上的细菌菌落，以确定接种量和大肠杆菌（E. coli）转胞吞量。确保对照平板上无任何细菌生长。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 无菌锥形管	MidSci	C15B
2 mL 微量离心管	Avant	AVSS2000
50 mL 无菌聚丙烯锥形管	Falcon	352070
离心机	Sorvall	Legend RT
一次性接种环	Fisherbrand	22363605
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11965-084
上皮细胞伏特/欧姆计	World Precision Instruments	EVOM
摇床培养箱	New Brunswick	Innova 4080
培养箱	Thermo Scientific	51030284	本方法中使用三个培养箱：一个用于无菌组织培养，一个用于感染组织培养，一个用于细菌培养。
LB 培养基（Lysogeny broth）	Difco	244610
LB 琼脂培养基（Lysogeny broth agar）	IBI Scientific	IB49101
分光光度计	Unico	1100RS
T84 肠道细胞	American Tissue Culture Collection	CCL248
组织培养小室，含聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，孔径 3 µm，24 孔板格式	Falcon	353096
组织培养板，24 孔	Falcon	353504