用于病毒颗粒生产的 Borrelia burgdorferi 培养物的制备与诱导

摘要

来源：Eggers, C. H. 噬菌体介导的莱姆病螺旋体Borrelia burgdorferi的遗传操作。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了经基因改造的伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）培养物的制备过程，该菌株被构建为携带含有抗生素抗性基因的休眠噬菌体DNA。经过抗生素筛选和培养后，化学诱导剂引发DNA损伤，导致携带抗性基因的噬菌体DNA被切除、复制并组装成新的病毒颗粒。经过第二次离心和重悬后，含有成熟病毒颗粒的细菌细胞即可用于后续实验应用。

方案

1. 准备 B. burgdorferi 用于φBB-1生产的培养

1. 制备添加了6.6%热灭活正常兔血清的Barbour-Stoenner-Kelly培养基（BSK）。配制1 L的1×BSK时，将表1中所列组分加入900 mL水中，用1 N氢氧化钠调节pH至7.6，在4 °C下缓慢搅拌混合2–4小时。混合完成后，检查并根据需要重新调节pH至7.6，加水定容至1 L。使用0.22 µM滤器（见材料表）过滤除菌，新鲜使用或于4 °C保存不超过2个月。
2. 在开始转导实验前3至5天，将150 µL适当的B. burgdorferi克隆接种于15 mL 1×BSK培养基中，使用带紧密盖子的无菌锥形离心管（见材料表）。根据需要在培养基中添加适当浓度的抗生素或抗生素组合，以用于在B. burgdorferi克隆中筛选和维持异源DNA（表2）。
   注意：B. burgdorferi属于生物安全二级病原体。操作时应采取所有适当的防护措施。所有活B. burgdorferi培养物的操作均须在经过认证且正确消毒的II级生物安全柜中进行。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）指南，妥善处理所有接触过B. burgd....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 L 滤器单元（PES，0.22 µm 孔径）	Millipore Sigma	S2GPU10RE
12 mm × 75 mm 管（双位置盖，聚丙烯）	USA Scientific	1450-0810	可容纳 4 mL，死体积低（用于诱导）
15 mL 圆锥形离心管（聚丙烯）	USA Scientific	5618-8271
1-甲基-3-亚硝基-硝基胍（MNNG）	Millipore Sigma		注意：潜在致癌物；目前不易获得，未测试替代品
5.75" 巴氏吸管（棉塞、硼硅酸盐玻璃、非无菌）	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	使用前需高压灭菌
50 mL 圆锥形离心管（聚丙烯）	USA Scientific	1500-1211
无水乙醇
Bacto 新胨	Gibco	DF0119-17-9
Bacto TC 酵母提取物	Gibco	255772
牛血清白蛋白（血清替代级）	Gemini Bio-Products	700-104P
CMRL-1066 无 L-谷氨酰胺（粉末）	US Biological	C5900-01	细胞培养级
红霉素	Research Products International Corp	E57000-25.0
庆大霉素试剂溶液	Gibco	15750-060
葡萄糖（无水右旋糖）	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
硫酸卡那霉素	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0
Millex-GS（0.22 µm 孔径）	Millipore Sigma	SLGSM33SS	用于过滤除菌抗生素及其他小体积溶液
丝裂霉素 C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	注意：潜在致癌物；仅可在化学通风橱中使用
N-乙酰-D-葡萄糖胺	MP Biomedicals, LLC	100068
培养皿（100 mm × 15 mm）	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
兔血清，非无菌，微量溶血，幼龄（NRS）	Pel-Freez Biologicals	31119-3	按制造商说明进行热灭活
碳酸氢钠	Thermo Fisher Scientific	BP328-500
丙酮酸钠	Millipore Sigma	P8674-25G
硫酸链霉素溶液	Millipore Sigma	S6501-50G
二水合柠檬酸三钠	Millipore Sigma	S1804-500G	用于 BSK 培养基的柠檬酸钠