来源：Eggers, C. H. 噬菌体介导的莱姆病螺旋体Borrelia burgdorferi的遗传操作。J. Vis. Exp. (2022)
本视频展示了经基因改造的伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）培养物的制备过程，该菌株被构建为携带含有抗生素抗性基因的休眠噬菌体DNA。经过抗生素筛选和培养后，化学诱导剂引发DNA损伤，导致携带抗性基因的噬菌体DNA被切除、复制并组装成新的病毒颗粒。经过第二次离心和重悬后，含有成熟病毒颗粒的细菌细胞即可用于后续实验应用。
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方法文章
用于病毒颗粒生产的 Borrelia burgdorferi 培养物的制备与诱导
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2025年9月26日
本文内容
摘要
方案
1. 准备 B. burgdorferi 用于φBB-1生产的培养
- 制备添加了6.6%热灭活正常兔血清的Barbour-Stoenner-Kelly培养基（BSK）。配制1 L的1×BSK时，将表1中所列组分加入900 mL水中，用1 N氢氧化钠调节pH至7.6，在4 °C下缓慢搅拌混合2–4小时。混合完成后，检查并根据需要重新调节pH至7.6，加水定容至1 L。使用0.22 µM滤器（见材料表）过滤除菌，新鲜使用或于4 °C保存不超过2个月。
- 在开始转导实验前3至5天，将150 µL适当的B. burgdorferi克隆接种于15 mL 1×BSK培养基中，使用带紧密盖子的无菌锥形离心管（见材料表）。根据需要在培养基中添加适当浓度的抗生素或抗生素组合，以用于在B. burgdorferi克隆中筛选和维持异源DNA（表2）。
注意：B. burgdorferi属于生物安全二级病原体。操作时应采取所有适当的防护措施。所有活B. burgdorferi培养物的操作均须在经过认证且正确消毒的II级生物安全柜中进行。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）指南，妥善处理所有接触过B. burgdorferi的材料及该生物体本身。 - 将培养物在33 °C下静置培养，直至密度达到≥5 × 107个螺旋体·mL−1，通常需要约3–5天。
3. 诱导B. burgdorferi噬菌体 φBB-1
注意：所有玻璃器皿和塑料器皿均需通过高压灭菌进行灭菌；所有溶液需通过高压灭菌或经0.22 µM滤膜过滤进行灭菌。以下步骤基于15 mL体积进行描述，但该方法可根据实验的具体需求按比例放大或缩小体积。
- 对于将产生噬菌体的 B. burgdorferi 培养物（供体），使用步骤 2 中任一方法计算出的浓度，确定获得 4 mL 浓度为 2 × 108 螺旋体·mL−1 所需的起始培养物体积。在恢复阶段（如下步骤 3.6），这将使 15 mL 体系中的最终浓度达到 5 × 107 螺旋体·mL−1。
- 将步骤 3.1 计算出体积的培养物在 6,000 × g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 4 mL 新鲜 BSK 培养基中。将样品转移至可容纳样品且顶部空间最小的最小无菌管中。
- 根据 4 mL 的培养物体积，加入适量诱导剂至推荐浓度（表 3），以诱导噬菌体产生。 tightly 封盖试管并充分混匀。
- 将样品在 33 °C 下孵育 2–4 小时。
- 孵育结束后，将样品转移至 15 mL 离心管中。在 6,000 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 15 mL 1× BSK 培养基中。
表1：用于培养和筛选的BSK培养基 B. burgdorferi 用于转导实验的克隆。 1x BSK 培养基的配制与制备 B. burgdorferi 以及用于固相筛选的1.5x BSK B. burgdorferi 此处所述的克隆基于 Samuels 的方法。BSK（或 MKP）的不同配方 支持生长的 B. burgdorferi 尚未使用转导实验进行检测。
| 组分 | 1x BSK（用于培养）（1 L） | 1.5x BSK（用于涂板）（1 L） |
| 牛血清白蛋白（V组分） | 35 g | 52.5 g |
| 10x CMRL-1066（不含L-谷氨酰胺） | 8 g | 12 g |
| 新蛋白胨 | 4 g | 6 g |
| 酵母提取物水解物（yeastolate） | 1.6 g | 2.4 g |
| HEPES | 4.8 g | 7.2 g |
| 葡萄糖 | 4 g | 6 g |
| 柠檬酸钠 | 0.56 g | 0.84 g |
| 丙酮酸钠 | 0.64 g | 0.96 g |
| N-乙酰葡萄糖胺 | 0.32 g | 0.48 g |
| 碳酸氢钠 | 1.76 g | 2.64 g |
| 热灭活正常兔血清（INRS） | 66 mL | 99 mL |
表2：用于在B. burgdorferi中筛选和维持异源DNA的潜在抗生素及其使用浓度。 本列表基于目前在Borrelia burgdorferi中常用的抗生素抗性标记。卡那霉素、庆大霉素和链霉素用水配制，经0.22 µm滤膜过滤除菌后，于−20 °C保存。红霉素用95%乙醇配制，于−20 °C保存。许多实验室报道，在筛选时使用200 µg·mL−1的卡那霉素可获得成功；在转导实验中同时使用庆大霉素和卡那霉素进行筛选时，卡那霉素浓度为400 µg·mL−1。aadA基因赋予对链霉素和壮观霉素的双重抗性。在E. coli中筛选含有aadA基因的构建体时，使用100 µg·mL−1的壮观霉素。需要注意的是，氨基糖苷类抗生素（卡那霉素、庆大霉素和链霉素）在莱姆病的临床治疗中并无实际应用；然而，红霉素在某些临床情况下会被使用。尽管已有报道指出B. burgdorferi对红霉素存在天然抗性，但截至目前，在本研究报道的转导实验中尚未使用该抗生素抗性标记。
| 抗生素 | 储存液浓度 | 培养物中的终浓度 Bb |
| 卡那霉素 | 100 mg/mL-1 （在水中） | 200-400 μg·mL⁻¹-1 |
| 庆大霉素 | 50 mg/mL-1 （在水中） | 50 μg/mL-1 |
| 链霉素 | 50 mg/mL-1 （在水中） | 50 μg/mL-1 |
| 红霉素 | 2 mg·mL⁻¹-1 （在乙醇中） | 0.06 μg/mL-1 |
表3：用于诱导φBB-1的潜在诱导剂及其使用浓度 B. burgdorferi. N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）、丝裂霉素C和乙醇，以及甲醇和异丙醇，均已被证明可诱导φBB-1的表达水平超过其组成型表达水平 B. burgdorferi 菌株CA.11-2A。MNNG为疑似致癌物且具环境危害性；使用时需谨慎，应溶于可燃溶剂中，并通过焚烧处理废弃物。丝裂霉素C为疑似致癌物且具潜在环境危害性；应在化学通风橱中谨慎操作，并妥善处置。尽管已有发表数据表明MNNG是诱导φBB-1最有效的试剂，但因其存在操作风险且获取困难，使用较为复杂，尤其在学生实验中更为不便。乙醇诱导效果始终优于甲醇或异丙醇，且在转导实验中应用最为广泛。
| 诱导剂 | 储存浓度（溶剂） | 样品中的终浓度 |
| Ethanol | 100% (none) | 5% |
| Mitomycin C | 2 mg.mL-1 (water) | 20 μg.mL-1 |
| 1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | 50 mg.mL-1 (DMSO) | 10 μg.mL-1 |
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 L 滤器单元（PES，0.22 µm 孔径） | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| 12 mm × 75 mm 管（双位置盖，聚丙烯） | USA Scientific | 1450-0810 | 可容纳 4 mL，死体积低（用于诱导） |
| 15 mL 圆锥形离心管（聚丙烯） | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 1-甲基-3-亚硝基-硝基胍（MNNG） | Millipore Sigma | 注意：潜在致癌物；目前不易获得，未测试替代品 | |
| 5.75" 巴氏吸管（棉塞、硼硅酸盐玻璃、非无菌） | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | 使用前需高压灭菌 |
| 50 mL 圆锥形离心管（聚丙烯） | USA Scientific | 1500-1211 | |
| 无水乙醇 | |||
| Bacto 新胨 | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC 酵母提取物 | Gibco | 255772 | |
| 牛血清白蛋白（血清替代级） | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| CMRL-1066 无 L-谷氨酰胺（粉末） | US Biological | C5900-01 | 细胞培养级 |
| 红霉素 | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
| 庆大霉素试剂溶液 | Gibco | 15750-060 | |
| 葡萄糖（无水右旋糖） | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
| 硫酸卡那霉素 | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS（0.22 µm 孔径） | Millipore Sigma | SLGSM33SS | 用于过滤除菌抗生素及其他小体积溶液 |
| 丝裂霉素 C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | 注意：潜在致癌物；仅可在化学通风橱中使用 |
| N-乙酰-D-葡萄糖胺 | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| 培养皿（100 mm × 15 mm） | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 兔血清，非无菌，微量溶血，幼龄（NRS） | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | 按制造商说明进行热灭活 |
| 碳酸氢钠 | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
| 丙酮酸钠 | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| 硫酸链霉素溶液 | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| 二水合柠檬酸三钠 | Millipore Sigma | S1804-500G | 用于 BSK 培养基的柠檬酸钠 |
