利用细菌生物传感器检测目标分析物

摘要

来源： Barber, A. E., 等. 一种用于初步检测枪击残留物的新型细菌生物传感器的制备与应用. J. Vis. Exp. (2019).

本视频演示了使用细菌生物传感器检测特定分析物的方法。取一株含有质粒的细菌培养物，该质粒携带受分析物敏感型启动子调控的红色荧光蛋白（RFP）基因。在彻底擦拭待测表面后，将拭子的一小部分浸入该培养物中并进行孵育。分析物与启动子相互作用后可激活RFP的表达，从而确认目标分析物的存在。

方案

注意：展示了表达红色荧光蛋白（RFP）的大肠杆菌（E. coli）的合成过程。

1. 质粒脱氧核糖核酸（DNA）的制备 E. coli

1. 解冻 E.coli 含有带RFP基因和氨苄青霉素抗性基因质粒的菌株，并进行培养 E.coli 在含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB（Luria Broth）琼脂平板上，37 °C培养24小时。例如，可使用合成生物学标准生物部件注册库中的J10060质粒（见 材料表）。J10060 质粒包含一个由 pBad 启动子区域控制的 RFP 基因以及一个氨苄青霉素抗性基因。或者，可转化 E.coli （参考步骤3.2）在质粒转染前接种于LB琼脂平板。
2. 遵循标准的质粒小提实验步骤（参见 材料表) 从1 mL样品中分离DNA E. coli 含有 J10060 质粒的培养物。以下实验方案的目的是移除 pBad 启动子，并用目标装置所需的启动子取而代之。
3. 质粒小量提取后，将DNA储存于冰箱中，待进行酶切时取出使用。

2. 限制性内切酶消化

1. 在微量离心管中设置以下反应体系，用于EcoRI和NheI双酶切：10 μL J10060质粒DNA（步骤1中提取）、8 ....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,3-二硝基苯，97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-二硝基甲苯，97%	Aldrich	101397-5G
琼脂	Fisher Scientific	BP1423-500
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760-5
锑，标准溶液（1000 ppm ±1%/认证）	Fisher Scientific	SA450-100	稀释 HNO₃ 中的标准品
Cut Smart 缓冲液	New England BioLabs	B7204S
Duplex 缓冲液	Integrated DNA Technologies	11-01-03-00
EcoRI-HF 限制性内切酶	New England BioLabs	R3101S
乙醇，HPLC 级，变性	Acros Organics	AC611050040	溶剂无需 HPLC 级，ACS 级或试剂级即可满足要求。
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA 测序试剂盒	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Standard
菌落 PCR 正向引物	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
DNA 测序正向引物	Integrated DNA Technologies		5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science 高速质粒小提试剂盒	IBI Scientific	IB47101
LB 肉汤，Miller 配方	Fisher Scientific	BP1426-500
铅，标准溶液（1000 ppm ±1%/认证）	Fisher Scientific	SL21-100	稀释 HNO₃ 中的标准品
LeadOff 一次性清洁与去污湿巾	Hygenall	45NRCN	以罐装或单片独立包装形式出售，任何含酒精的擦拭巾均可使用。
甲醇，HPLC 级	Fisher Scientific	A452-4	溶剂无需 HPLC 级，ACS 级或试剂级即可满足要求。
NEB 5-alpha 感受态 E. coli 细胞	New England BioLabs	C2987I
NheI-HF 限制性内切酶	New England BioLabs	R3131S
无核酸酶水	New England BioLabs	B1500S
OneTaq 2X 预混液（含标准缓冲液）	New England BioLabs	M0482S
用于合成生物学的标准生物部件注册库中的质粒	标准生物部件注册库		http://parts.igem.org/Main_Page
启动子序列	Integrated DNA Technologies		Sb 启动子：5’-GCATGAATTCAGTCATATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAGAGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACTGAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGACGTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb 启动子：5’-GCATGAATTCGTCTTGACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCAACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTGATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT 启动子：5’GCATTCTAGATCAATTTATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCACATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAATCACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTAATTAACTTAAGCGTA5’
菌落 PCR 反向引物	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
DNA 测序反向引物	Integrated DNA Technologies		5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA 连接酶	New England BioLabs	M0202S