利用细菌生物传感器检测目标分析物

摘要

来源： Barber, A. E., 等. 一种用于初步检测枪击残留物的新型细菌生物传感器的制备与应用. J. Vis. Exp. (2019).

本视频演示了使用细菌生物传感器检测特定分析物的方法。取一株含有质粒的细菌培养物，该质粒携带受分析物敏感型启动子调控的红色荧光蛋白（RFP）基因。在彻底擦拭待测表面后，将拭子的一小部分浸入该培养物中并进行孵育。分析物与启动子相互作用后可激活RFP的表达，从而确认目标分析物的存在。

方案

注意：展示了表达红色荧光蛋白（RFP）的大肠杆菌（E. coli）的合成过程。

1. 质粒脱氧核糖核酸（DNA）的制备 E. coli

1. 解冻 E.coli 含有带RFP基因和氨苄青霉素抗性基因质粒的菌株，并进行培养 E.coli 在含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB（Luria Broth）琼脂平板上，37 °C培养24小时。例如，可使用合成生物学标准生物部件注册库中的J10060质粒（见 材料表）。J10060 质粒包含一个由 pBad 启动子区域控制的 RFP 基因以及一个氨苄青霉素抗性基因。或者，可转化 E.coli （参考步骤3.2）在质粒转染前接种于LB琼脂平板。
2. 遵循标准的质粒小提实验步骤（参见 材料表) 从1 mL样品中分离DNA E. coli 含有 J10060 质粒的培养物。以下实验方案的目的是移除 pBad 启动子，并用目标装置所需的启动子取而代之。
3. 质粒小量提取后，将DNA储存于冰箱中，待进行酶切时取出使用。

2. 限制性内切酶消化

1. 在微量离心管中设置以下反应体系，用于EcoRI和NheI双酶切：10 μL J10060质粒DNA（步骤1中提取）、8 μL水，以及EcoRI和NheI酶各1 μL（每种酶预先与1 μL缓冲液混合，参见材料表）。
2. 对于启动子DNA，在微量离心管中设置以下反应体系，用于EcoRI和NheI双酶切：10 μL退火后的启动子DNA序列（8 μL水，以及EcoRI和NheI酶各1 μL，每种酶预先与1 μL缓冲液混合）。
   1. 对于锑（Sb-）、铅（Pb-）或三硝基甲苯（TNT）-RFP（参见材料表），将寡核苷酸溶解于缓冲液（30 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 7.5；100 mM醋酸钾）中，以等摩尔浓度混合后孵育，94 °C加热2分钟，然后在室温下逐渐冷却。
3. 用移液器将样品轻轻吹打混匀（移液器设定体积为10 μL）。
4. 在37 °C孵育30分钟。
5. 在80 °C加热5分钟以灭活酶。
6. 将酶切后的DNA保存于冰箱中，待进行下一步实验时使用。

3. 连接与转化

1. 连接反应
   1. 取第2步中经EcoRI和NheI双酶切的质粒DNA和启动子DNA，在冰上于微量离心管中配制表1所示的反应体系；最后加入T4 DNA连接酶。注意：表1所示连接反应中，载体与插入片段的摩尔比为1:3，适用于所指示的DNA大小。
   2. 用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心。
   3. 室温孵育10分钟。
   4. 65 °C加热10分钟以终止反应。
2. 转化
   1. 将含有20 µL DH5-alpha感受态E. coli细胞的离心管置于冰上解冻，直至最后一粒冰晶消失。
   2. 向细胞混合物中加入5 µL质粒DNA。轻轻弹击管壁4–5次，使细胞与DNA充分混匀。
   3. 将混合物置于冰上静置2分钟。
   4. 精确在42 °C热激30秒。期间不要混匀。
   5. 再次置于冰上静置2分钟。期间不要混匀。
   6. 加入380 µL室温的含分解代谢物阻遏的超优培养液（SOC），立即涂布于含氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。
   7. 24小时内观察平板上的菌落生长情况。
   8. 用封口膜密封平板，置于冰箱中保存，待下一步使用。

4. 菌落聚合酶链式反应（PCR）

1. 加入PCR管中（共设置4个反应管），反应混合物如下所示 表2.
2. 用移液器轻轻吹打混匀反应液。
3. 使用黄色移液枪头刮取转化后的菌落（或极小区域） E. coli. 转移此拭子样本 大肠杆菌 转移到已分区的LB/氨苄青霉素/琼脂平板上，然后将移液器吸头插入PCR管中，轻轻振荡移液器吸头以混匀 大肠杆菌 加入PCR混合液。对另外三个菌落重复上述操作。将PCR管转移至PCR仪中，并按照所示程序开始热循环。 表3.
4. 使用含2%琼脂糖的TAE（Tris-乙酸-EDTA）凝胶进行凝胶电泳，以确定哪些菌落的质粒连接效果最佳，并将这些菌落接种至新的培养皿中培养。
5. 将培养板存放于冰箱中，待测试时取出。为进行化学检测，配制含100 µg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养液。

5. DNA 测序

1. 每个样品中加入 5 µL 质粒、4 µL 测序引物和 3 µL 去离子水。
2. 将该混合物放入离心管中，并送样进行 DNA 测序（参见 材料表）。
3. 分析 DNA 测序数据，使用 DNA 序列分析软件比较预期与实际获得的 DNA 序列，以确认无突变发生且基因已正确插入。
   注意：下文以 E. coli 作为化学传感器的应用为例进行说明。

6. 大肠杆菌E. coli培养物的制备

1. 准备含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基用于液体培养。
2. 分别制备传感细菌、阳性对照* 细菌和阴性对照** 细菌的液体培养物。
   注意：*阳性对照细菌：E. coli 携带一个质粒，该质粒含有在组成型启动子控制下的 RFP 基因；本研究中使用了合成生物学标准生物部件注册库中的质粒 E1010（参见材料表）。**阴性对照细菌：E. coli 携带一个质粒，该质粒含有在不同启动子（如 pBad 启动子）控制下的 RFP 基因（使用合成生物学标准生物部件注册库中的质粒 J10060（参见材料表）），或 不含 RFP 基因的质粒。
3. 将培养物置于 37 °C、220 rpm 的摇床培养箱中培养，时间不少于 8 小时，最长不超过 18 小时。培养液变浑浊表明细菌已生长。

7. 滴定 大肠杆菌 检测设备的功能

注意：传感器经滴定验证功能后，此步骤无需重复。每次使用时可通过添加铅、锑以及2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT）或1,3-二硝基苯（1,3-DNB）作为阳性对照，以检测装置功能，而无需进行完整的滴定过程。

1. 将目标分析物配制成浓度为 10 ppm 的水溶液作为储备液。若溶解度存在问题，可使用 50/50 的水/甲醇混合溶液。
2. 参照表 4，标记相应数量的无菌培养管，并将 2 mL 培养液（来自方案步骤 6）加入每根试管中。
   注意：为确定大致的分析范围，应使用传感器细菌对至少三个不同浓度水平的分析物进行检测，同时设置一个阴性对照组和一个阳性对照组。此外，每种细菌还应设一根不添加金属的试管（另一种类型的阴性对照）。为更准确地确定分析范围和检测限，应使用更宽范围的分析物浓度。
3. 按照表 4所示，向含有 2 mL 培养液的试管中加入分析物储备液，将扣盖轻轻盖在培养管上（保持松动以允许空气进入），然后涡旋混匀培养管。
4. 保持扣盖松动，将培养管置于摇床培养箱中，在 220 rpm、37 °C 条件下培养至少 24 小时。
5. 从培养箱中取出试管，将扣盖紧密封闭，并将试管冷藏保存，直至进行荧光分析。

8. 利用E. coli作为化学传感器检测枪击残留物（GSR）

1. 使用专为去除铅设计的乙醇擦拭巾（参见材料表），擦拭双手的所有表面，包括指缝之间。每只手使用一张独立的擦拭巾。将使用过的擦拭巾存放在贴有适当标签的可密封袋中，直至进行分析。
2. 对于待检测的表面，大面积表面使用基于酒精的擦拭巾，小面积表面则使用经乙醇润湿的棉签。
   注意：为演示传感器对GSR的响应，使用经乙醇润湿的棉签擦拭了已使用过的.40口径弹壳内表面。
3. 佩戴洁净手套，并使用经酒精清洁过的剪刀，从擦拭巾中心剪下约1 cm²的区域。
4. 将剪下的手部擦拭巾样品或棉签直接放入含有2 mL传感器细菌的培养管中，确保其完全浸没于培养液中。
5. 按照上述步骤7.4 – 7.5所述继续操作。

表1. 连接反应混合物，实验方案步骤3.1.1。

组分	20 μL 反应体系
10X T4 DNA 连接酶缓冲液	2 μL
质粒 DNA (3 kb)	3 μL
启动子 DNA (0.7 kb)	10 μL
无核酸酶水	4 μL
T4 DNA 连接酶	1 μL

表2. 菌落PCR的反应混合物，方案步骤4.1。

组分	25 μL 反应体系
10 µM 正向引物	0.5 µL
10 µM 反向引物	0.5 µL
OneTaq 2X 预混液	12.5 µL
无核酸酶水	11 µL

表3. 第4.3步实验方案的PCR热循环参数。

步骤	温度	时间
初始变性	94 °C	30 s
30 个循环	94 °C	30 s
	55 °C	45 s
	68 °C	60 s
最终延伸	68 °C	5 min
保存	4 °C

表4. 生物传感器滴定的一般实验设置，方案步骤7.2。

试管编号	细菌	添加的分析物溶液浓度 (ppm)	添加的金属	加入 2,000 µL 培养基中的分析物溶液体积	[分析物], ppb
1	PbRFP	10	Pb	2.5	12
2	PbRFP	10	Pb	75	361
3	PbRFP	10	Pb	150	698
4	PbRFP	0	none	0	0
5	RFP neg	10	Pb	10	50
6	RFP pos	10	Pb	10	50

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,3-二硝基苯，97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-二硝基甲苯，97%	Aldrich	101397-5G
琼脂	Fisher Scientific	BP1423-500
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760-5
锑，标准溶液（1000 ppm ±1%/认证）	Fisher Scientific	SA450-100	稀释 HNO₃ 中的标准品
Cut Smart 缓冲液	New England BioLabs	B7204S
Duplex 缓冲液	Integrated DNA Technologies	11-01-03-00
EcoRI-HF 限制性内切酶	New England BioLabs	R3101S
乙醇，HPLC 级，变性	Acros Organics	AC611050040	溶剂无需 HPLC 级，ACS 级或试剂级即可满足要求。
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA 测序试剂盒	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Standard
菌落 PCR 正向引物	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
DNA 测序正向引物	Integrated DNA Technologies		5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science 高速质粒小提试剂盒	IBI Scientific	IB47101
LB 肉汤，Miller 配方	Fisher Scientific	BP1426-500
铅，标准溶液（1000 ppm ±1%/认证）	Fisher Scientific	SL21-100	稀释 HNO₃ 中的标准品
LeadOff 一次性清洁与去污湿巾	Hygenall	45NRCN	以罐装或单片独立包装形式出售，任何含酒精的擦拭巾均可使用。
甲醇，HPLC 级	Fisher Scientific	A452-4	溶剂无需 HPLC 级，ACS 级或试剂级即可满足要求。
NEB 5-alpha 感受态 E. coli 细胞	New England BioLabs	C2987I
NheI-HF 限制性内切酶	New England BioLabs	R3131S
无核酸酶水	New England BioLabs	B1500S
OneTaq 2X 预混液（含标准缓冲液）	New England BioLabs	M0482S
用于合成生物学的标准生物部件注册库中的质粒	标准生物部件注册库		http://parts.igem.org/Main_Page
启动子序列	Integrated DNA Technologies		Sb 启动子：5’-GCATGAATTCAGTCATATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAGAGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACTGAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGACGTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb 启动子：5’-GCATGAATTCGTCTTGACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCAACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTGATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT 启动子：5’GCATTCTAGATCAATTTATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCACATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAATCACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTAATTAACTTAAGCGTA5’
菌落 PCR 反向引物	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
DNA 测序反向引物	Integrated DNA Technologies		5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA 连接酶	New England BioLabs	M0202S