可视化细菌表面运动性的群集迁移实验

摘要

来源：Morales-Soto, N. 等，细菌表面运动性实验的制备、成像与定量。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了一种利用表达绿色荧光蛋白的细菌进行的群集运动实验，用于观察细菌在软琼脂表面的运动能力。通过延时成像技术，捕捉到细菌群体协调扩展及须状结构形成的过程，凸显了细菌的表面运动特性。

方案

1. 群集实验培养基的制备与接种

1. 培养基制备
   注意： 下述培养基成分适用于 铜绿假单胞菌 卷须形成研究。请参见媒体规格说明 表1 用于 铜绿假单胞菌, 枯草芽孢杆菌，以及 Myxococcus xanthus 表面运动性测定
   1. 混合 200 ml 流化好氧生物反应器（FAB）减去硫酸铵（(NH4)₂SO₄) 群体运动培养基（材料表）、0.9 g 结晶琼脂和 0.2 g 酪蛋白氨基酸表1通过磁力搅拌器搅拌完成。使用小体积（100–300 ml）以提高实验间的一致性。
   2. 使用22分钟暴露时间、121.1 °C暴露温度以及快速排气模式，对200 ml琼脂/培养基混合物进行高压灭菌。高压灭菌设置可实现充分灭菌和琼脂融化，同时防止琼脂焦化。
      注意： 琼脂容易发生焦糖化；焦糖化的琼脂会改变细菌的运动能力。
   3. 灭菌程序结束后，立即盖紧培养基瓶的瓶盖，以防止水分蒸发损失。但需注意，过紧地盖紧瓶盖可能会在瓶内产生类似“真空密封”的效应。
   4. 将培养基在室温下搅拌并冷却至 50 °C，加入 2 ml 无菌的 1.2 M 葡萄糖。或者，将培养基置于 60 °C 培养箱或水浴中，直至使用前（最迟不超过 15 小时），然后按指示操作。为防止培养基中产生气泡，需使用磁力搅拌子充分混匀；琼脂表面的气泡会阻碍细菌的均匀扩散。
      注意： 对于其他检测，在此步骤中根据需要添加不能高压灭菌的热敏感成分，如额外的营养物质或染料（例如，每100 ml熔化的琼脂中加入8 µl Invitrogen Syto 63染料用于成像 M. xanthus, 如以下“代表性结果”所示。某些染料的添加可能影响群集运动的基线行为，应通过与不含染料的对照组进行比较来验证。
   5. 在实验室通风橱中，每60 mm直径的聚苯乙烯培养皿分装7.5 ml无菌培养基，并将培养皿单层放置（勿堆叠）。若需更大的群体迁移表面，每100 mm直径培养皿分装25 ml培养基。务必在水平台面上分装培养基，使用圆水准器检查台面是否水平。
      注意： 对于 P. aeruginosa 使用每孔特定的培养基体积可提高检测的一致性和可重复性。对于 B. subtilis 和 M. xanthus 检测、手工分装所得结果与特定体积等分试样相当。
2. 平板固化
   1. 对于小培养皿（60 mm），将融化的琼脂培养基置于超净台中，敞口使其凝固（既形成半固体状态，又蒸发掉多余液体）即，不加盖）30分钟。较大的培养皿（100 mm）需要更长的固化时间（见讨论部分）。
      注意： 或者，某些检测可能需要将板子在室温下静置过夜（20–24 小时），并加以覆盖即，盖上盖子）单层放置表1。群集运动对湿度过高和不足均敏感。实验室中的湿度、气流和温度条件可能需要调整平板干燥时间，以促进目标细菌的最佳群集运动。
   2. 干燥期结束后立即进行平板接种。切勿将平板储存以供后续使用。
      1. 通过在测试平板上点样10 µl含有0.50%（体积/体积）Higgins防水黑色印度墨水与细菌接种物的混合液，进行“墨水扩散试验”。如果墨水/接种物混合液易于扩散（即， 在培养基表面未保持液滴形态（即液滴扩散）的情况下，需要额外时间使培养基干燥。
         注意： 对于对湿度特别敏感的物种（例如, P. aeruginosa），进行快速“墨水扩散测试”以确定平板是否已充分干燥。
3. 群体迁移实验接种
   1. 接种6 ml液体培养基（参见 表1 有关细节，请使用新鲜培养皿上分离的单个菌落（< 5天（室温放置）的LB（Lysogeny Broth）平板培养物。将液体培养物在30 °C或37 °C下水平振荡（240 rpm）培养过夜（≤18小时）。
   2. 通过点加1-5 µl过夜培养的肉汤菌液，或用无菌牙签或接种针轻戳琼脂的方式，接种群集运动平板。
      注意： 我们更倾向于后一种方法，因为它降低了接种物飞溅的可能性，并避免向群集表面增加额外的水分。
4. 群体迁移实验培养
   1. 对于一般检测，将群集运动检测平板在 30 °C 或 37 °C（或甚至 42 °C，用于 B. subtilis; 表格 1——这是细菌特异性的。培养时将平板倒置，使多余的水分凝结在盖子上，而不是琼脂表面。
      注意： 温度可影响表型和动力学。对于 P. aeruginosa 在37 °C下培养比在30 °C下培养生长更快，群落扩展更迅速；然而，温度变化通常会导致这些群落的形态有所不同。
   2. 对于延时成像，将群集培养板置于适宜温度下孵育，然后转移至成像工作站（参见 表1 详情见正文。
      注意： 此预成像孵育步骤可使菌群在转移至新环境前启动发育并稳定建立，而新环境对群集运动而言可能适宜也可能不适宜。

2. 表面运动性实验的宏观成像

1. 对于延时成像，在预成像孵育期结束后，将 swarm 实验平板放置于商用 in vivo 成像系统内透明成像板上的指定位置。每次可同时成像最多六个直径为 60 mm 或四个直径为 100 mm 的平板。由于相机从成像平面下方采集图像，需将平板倒置放置，以确保光路不被阻挡。或者，在整个实验期间将平板置于 30 °C 或 37 °C（表 1）下孵育，并在设定的时间间隔从培养箱中取出平板进行成像。
2. 将培养皿的皿盖朝上，盖在盛有接种培养基的对应平板上方。在培养皿的皿盖内加入水，以防止成像过程中培养基过度干燥，并使用另一个透明托盘将整个装置完全封闭，以维持实验全过程的湿度环境。
3. 使用分子成像（Molecular Imaging, MI）软件，在室温下按照 表 2 中描述的成像参数运行实验。对于延时成像，需设置包含必要步骤和参数的成像程序。

表1：表面运动性检测制备规格。 包含铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和黄色粘球菌（M. xanthus）的表面运动性检测制备规格。

	P. aeruginosa	P. aeruginosa 菌丝形成研究	B. subtilis	M. xanthus
过夜液体培养基	FAB 加 30 mM 葡萄糖	FAB 加 30 mM 葡萄糖	LB	CTT（复合培养基）
过夜液体培养孵育温度	37 °C	37 °C	37 °C	30 小时，30 °C
迁移培养基	FAB	FAB 缺 (NH4)2SO4	2% (wt/vol) LB	CTT
迁移培养基：额外组分	12 mM 葡萄糖a	10% (wt/vol) 酪蛋白氨基酸（CAA），12 mM 葡萄糖a	n/a	SYTO® 64a
琼脂类型	琼脂，Noble	琼脂，Noble	颗粒状琼脂	琼脂，Noble Affymetrix
琼脂浓度 (wt/vol)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
迁移平板尺寸	60 mm	60 mm	100 mm	150 mm
每板培养基体积	7.5 ml	7.5 ml	手工倾注	手工倾注
迁移培养基凝固/干燥方式	通风橱；平板敞口	通风橱；平板敞口	台面，平板加盖	台面，平板加盖
迁移培养基凝固/干燥时间	30 分钟	30 分钟	过夜（20–24 小时）	过夜（20–24 小时）
迁移实验孵育温度	30 或 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
延时成像孵育条件	30 °C 至少 4 小时	30 °C 至少 4 小时	37 °C 2 小时	室温 12 小时
延时成像持续时间	24 小时	24 小时	10 小时	66 小时
延时成像设置	每 10 分钟 1 帧	每 10 分钟 1 帧	每 6 分钟 1 帧	每 10 分钟 1 帧
a 经高压灭菌后添加。

表2： 成像参数。 用于细菌表面生长的红色和绿色荧光及生物发光成像的Bruker成像系统参数。

信号	绿色荧光	红色荧光 I	红色荧光 II	发光
蛋白或染料	绿色荧光蛋白（GFP）	mCherry 蛋白或尼罗红鼠李糖脂染色	SYTO® 64	来自lux 操纵子的荧光素酶
激发波长（nm）	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	关闭
发射波长（nm）	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	无滤光片
曝光时间（秒）	30	60	60	240
f-值	4.0	4.0	2.5	1.1
视场（mm）	190	190	140	120
焦平面（mm）	27.5	27.5	12.2	4
像素合并（像素）	无	2 × 2	无	8 × 8

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂a：
FAB 最小培养基：				每约 4 周配制一次。用纳米纯 H2O 定容至 1 L。
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	2 g	P. aeruginosa 须状结构形成研究中不使用。
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	9 g
KH2PO4	Sigma	P5655	3 g
NaCl	BDH	BDH8014	3 g
MgCl2 x 6H2O 溶液 (198 g/L)	Fisher Scientific	M33	1 ml
CaCl2 x 2H2O 溶液 (14 g/L)	Fisher Scientific	C79	1 ml
微量元素溶液（见下文）	n/a	n/a	1 ml
微量元素溶液：				用纳米纯 H2O 定容至 1 L。保存于玻璃瓶中，搅拌并用铝箔覆盖。
CaSO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 mg
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	M7634	20 mg
CuSO4 x 5H2O	Fisher Scientific	C493	20 mg
ZnSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750	20 mg
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	C6768	10 mg
NaMoO4 x 2H2O	Sigma	S6646	10 mg
H3BO3	Fisher Scientific	A74	5 mg
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002	200 mg
CTT 培养基：				按需配制。用纳米纯 H2O 定容至 100 ml。
Tris-HCl，1 M 溶液（调至 pH 8.0）	Amresco	234	1 ml	用纳米纯 H2O 配制 1 M 储存液。调节 pH 至 8.0，并过滤除菌（0.2 μm 滤膜）。
K2HPO4，1 M 溶液（调至 pH 7.6）	Sigma-Aldrich	P3786	0.1 ml	用纳米纯 H2O 配制 1 M 储存液。调节 pH 至 7.6，并过滤除菌（0.2 μm 滤膜）。
MgSO4 溶液	Fisher Scientific	M65	0.8 ml	用纳米纯 H2O 配制 1 M 储存液。过滤除菌（0.2 μm 滤膜）。
蛋白胨	BD Diagnostics	225930	1 g
其他试剂：
LB 肉汤，Lennox	BD Diagnostics	240230	2 % (wt/vol)
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767	过夜液体培养为 30 mM；泳动培养基为 12 mM	用纳米纯 H2O 配制 1.2 M 过滤除菌储存液。在培养基灭菌后加入。
酪蛋白氨基酸（CAA）	Amresco	J851	0.10 % (wt/vol)	推荐用于 P. aeruginosa 须状结构形成研究。在培养基灭菌前加入。
琼脂，Noble	Sigma-Aldrich	A5431	0.45 % (wt/vol)	推荐用于 P. aeruginosa 表面运动性研究。在培养基灭菌前加入。
琼脂，Noble	Affymetrix	10907	1.50 % (wt/vol)	用于 M. xanthus 表面运动性研究。不推荐用于 P. aeruginosa 运动性研究。在培养基灭菌前加入。
琼脂，颗粒状	Fisher Scientific	BP1423	0.60 % (wt/vol)
Higgins 防水黑色印度墨水	Higgins	HIG44201	0.50 % (vol/vol)	将墨水与接种物混合以检测泳动培养基表面湿度。
SYTO® 64 红色荧光核酸染料	Invitrogen	S-11346		每 100 ml 熔融琼脂中加入 4 μl（用于 P. aeruginosa）或 8 µl（用于 M. xanthus）SYTO® 64（灭菌后加入）。
相关材料与设备：
培养皿，无菌，150 mm x 15 mm（直径 x 高）	VWR	25384-326
培养皿，无菌，100 mm x 15 mm（直径 x 高）	VWR	25384-342
培养皿，无菌，60 mm x 15 mm（直径 x 高）	VWR	25384-092
In-Vivo Xtream	Bruker			用于表面运动性研究的宏观成像。http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html