可视化细菌表面运动性的群集迁移实验

摘要

来源：Morales-Soto, N. 等，细菌表面运动性实验的制备、成像与定量。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了一种利用表达绿色荧光蛋白的细菌进行的群集运动实验，用于观察细菌在软琼脂表面的运动能力。通过延时成像技术，捕捉到细菌群体协调扩展及须状结构形成的过程，凸显了细菌的表面运动特性。

方案

1. 群集实验培养基的制备与接种

1. 培养基制备
   注意： 下述培养基成分适用于 铜绿假单胞菌 卷须形成研究。请参见媒体规格说明 表1 用于 铜绿假单胞菌, 枯草芽孢杆菌，以及 Myxococcus xanthus 表面运动性测定
   1. 混合 200 ml 流化好氧生物反应器（FAB）减去硫酸铵（(NH4)₂SO₄) 群体运动培养基（材料表）、0.9 g 结晶琼脂和 0.2 g 酪蛋白氨基酸表1通过磁力搅拌器搅拌完成。使用小体积（100–300 ml）以提高实验间的一致性。
   2. 使用22分钟暴露时间、121.1 °C暴露温度以及快速排气模式，对200 ml琼脂/培养基混合物进行高压灭菌。高压灭菌设置可实现充分灭菌和琼脂融化，同时防止琼脂焦化。
      注意： 琼脂容易发生焦糖化；焦糖化的琼脂会改变细菌的运动能力。
   3. 灭菌程序结束后，立即盖紧培养基瓶的瓶盖，以防止水分蒸发损失。但需注意，过紧地盖紧瓶盖可能会在瓶内产生类似“真空密封”的效应。
   4. 将培养基在室温下搅拌并冷却至 50 °C，加入 2 ml 无菌的 1.2 M 葡萄糖。或者，将培养基置于 60 °C 培养箱或水....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂a：
FAB 最小培养基：				每约 4 周配制一次。用纳米纯 H2O 定容至 1 L。
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	2 g	P. aeruginosa 须状结构形成研究中不使用。
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	9 g
KH2PO4	Sigma	P5655	3 g
NaCl	BDH	BDH8014	3 g
MgCl2 x 6H2O 溶液 (198 g/L)	Fisher Scientific	M33	1 ml
CaCl2 x 2H2O 溶液 (14 g/L)	Fisher Scientific	C79	1 ml
微量元素溶液（见下文）	n/a	n/a	1 ml
微量元素溶液：				用纳米纯 H2O 定容至 1 L。保存于玻璃瓶中，搅拌并用铝箔覆盖。
CaSO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 mg
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	M7634	20 mg
CuSO4 x 5H2O	Fisher Scientific	C493	20 mg
ZnSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750	20 mg
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	C6768	10 mg
NaMoO4 x 2H2O	Sigma	S6646	10 mg
H3BO3	Fisher Scientific	A74	5 mg
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002	200 mg
CTT 培养基：				按需配制。用纳米纯 H2O 定容至 100 ml。
Tris-HCl，1 M 溶液（调至 pH 8.0）	Amresco	234	1 ml	用纳米纯 H2O 配制 1 M 储存液。调节 pH 至 8.0，并过滤除菌（0.2 μm 滤膜）。
K2HPO4，1 M 溶液（调至 pH 7.6）	Sigma-Aldrich	P3786	0.1 ml	用纳米纯 H2O 配制 1 M 储存液。调节 pH 至 7.6，并过滤除菌（0.2 μm 滤膜）。
MgSO4 溶液	Fisher Scientific	M65	0.8 ml	用纳米纯 H2O 配制 1 M 储存液。过滤除菌（0.2 μm 滤膜）。
蛋白胨	BD Diagnostics	225930	1 g
其他试剂：
LB 肉汤，Lennox	BD Diagnostics	240230	2 % (wt/vol)
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767	过夜液体培养为 30 mM；泳动培养基为 12 mM	用纳米纯 H2O 配制 1.2 M 过滤除菌储存液。在培养基灭菌后加入。
酪蛋白氨基酸（CAA）	Amresco	J851	0.10 % (wt/vol)	推荐用于 P. aeruginosa 须状结构形成研究。在培养基灭菌前加入。
琼脂，Noble	Sigma-Aldrich	A5431	0.45 % (wt/vol)	推荐用于 P. aeruginosa 表面运动性研究。在培养基灭菌前加入。
琼脂，Noble	Affymetrix	10907	1.50 % (wt/vol)	用于 M. xanthus 表面运动性研究。不推荐用于 P. aeruginosa 运动性研究。在培养基灭菌前加入。
琼脂，颗粒状	Fisher Scientific	BP1423	0.60 % (wt/vol)
Higgins 防水黑色印度墨水	Higgins	HIG44201	0.50 % (vol/vol)	将墨水与接种物混合以检测泳动培养基表面湿度。
SYTO® 64 红色荧光核酸染料	Invitrogen	S-11346		每 100 ml 熔融琼脂中加入 4 μl（用于 P. aeruginosa）或 8 µl（用于 M. xanthus）SYTO® 64（灭菌后加入）。
相关材料与设备：
培养皿，无菌，150 mm x 15 mm（直径 x 高）	VWR	25384-326
培养皿，无菌，100 mm x 15 mm（直径 x 高）	VWR	25384-342
培养皿，无菌，60 mm x 15 mm（直径 x 高）	VWR	25384-092
In-Vivo Xtream	Bruker			用于表面运动性研究的宏观成像。http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html