用于可视化细菌表面运动的蜂群测定

摘要

资料来源： Morales-Soto， N. 等人， 细菌表面运动测定的制备、成像和定量。 J. Vis. Exp. （2015年）

该视频演示了使用表达绿色荧光蛋白的细菌来观察软琼脂表面运动的蜂群测定。延时成像捕捉协调的扩张和卷须形成，突出细菌表面运动。

方案

1. 群体测定培养基制备和接种

1. 培养基准备
   注意： 下述培养基成分适用于 铜绿假单胞菌 卷须形成研究。请参阅 表 1 中铜 绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌和黄 氏粘球菌 表面运动测定的培养基规格。
   1. 用磁力搅拌棒搅拌，混合200ml流化好氧生物反应器（FAB）-减硫酸铵（（NH4）₂SO₄）群培养基（材料表），0.9g贵贵琼脂和0.2g豆类酸（表1）。使用小体积（100-300 毫升）以提高实验之间的一致性。
   2. 使用22分钟的暴露时间，121.1°C的暴露温度和快速排气选项高压灭菌200ml琼脂/培养基混合物。高压灭菌器设置将允许适当的灭菌和琼脂融化，但会防止琼脂焦糖化。
      注意： 贵贵琼脂容易焦糖化;焦糖琼脂上的细菌运动性发生变化。
   3. 灭菌循环结束后，立即盖上培养基瓶的盖子，以防止水分因蒸发而流失。但是，请注意，封盖紧密会对瓶子造成类似“真空密封”的效果。
   4. 将培养基冷却至50°C，同时在室温（RT）下搅拌，并加入2ml无菌1.2M葡萄糖。或者，将培养基置于 60 °C 培养箱或水浴中，直到可以使用（最多 15 小时后），然后按照指示进行。为防止介质中形成气泡，请使用磁力搅拌棒彻底混合;琼脂表面的气泡会阻止均匀的蜂拥而至。
      注意： 对于其他测定，根据需要在此步骤添加无法高压灭菌的热敏成分，例如额外的营养物质或染料（例如，每100 ml融化琼脂8μl Invitrogen Syto 63染料以对黄 原分枝杆菌进行成像 ， 如下面的代表性结果所示）。添加某些染料可能会影响基线蜂群行为，应根据非染料对照进行检查。
   5. 在实验室罩中，每60mm直径的聚苯乙烯培养皿等分7.5ml无菌培养基，并将板保持在单层（不堆叠）。对于更大的蜂群表面，每个直径为100毫米的培养皿等分25毫升培养基。在均匀的水平表面上填充盘子很重要。使用靶心水平仪检查表面是否水平。
      注意： 对于 铜绿假单胞菌 测定，每个板使用特定的培养基体积将提高一致性和重现性。对于 枯草芽孢杆菌 和 黄花芽孢 杆菌测定，手工浇注产生的结果与特定体积等分试样相当。
2. 板材固化
   1. 对于小板（60 mm），让融化的琼脂培养基在未盖盖（即没有盖子）的罩中固化（均设置为半固体和干燥多余液体）30 分钟。较大的板（100 mm）需要更长的固化时间（参见讨论）。
      注意： 或者，一些测定可能需要将板在台面上固化过夜（20-24小时），覆盖（即盖上）单层（表1）。蜂群对水分过多和不足都很敏感。任何给定实验室的湿度、气流和温度可能需要改变板固化，以促进细菌的最佳蜂群。
   2. 干燥期结束后立即接种板。请勿存放盘子以备进一步使用。
      1. 通过用 0.50% （vol/vol） Higgins 防水黑印度墨水和细菌接种物的 10 μl 混合物点样测试板来执行“油墨扩散测试”。如果墨水/接种物混合物容易在培养基表面扩散（即不 保留液滴形式），则培养基将需要额外的时间来干燥。
         注意： 对于对湿度特别敏感的物种（例如铜 绿假单胞菌），进行快速“油墨扩散测试”以确定印版是否足够干燥。
3. 群体检测接种
   1. 用新鲜（如果在室温下放置<5天）溶原肉汤（LB）平板培养物的分离菌落接种6ml肉汤培养基（详见 表1 ）。将肉汤培养物在 30°C 或 37°C 下水平摇动 （240 rpm） 孵育过夜（≤18 小时）。
   2. 通过用 1-5 μl 过夜肉汤培养物点样，或用无菌牙签或金属丝接种针“戳”琼脂来接种群板。
      注意： 我们更喜欢后一种方法，因为它降低了接种物飞溅的可能性，并防止向蜂群表面积添加额外的水分。
4. 群体检测孵育
   1. 对于一般测定，将群体测定板在30°C或37°C（枯草芽孢杆菌甚至42°C;表1）——这是细菌特异性的。在孵育过程中倒置板，使多余的水分凝结在盖子上，而不是琼脂上。
      注意： 温度会影响表型和动力学。对于 铜绿假单胞 菌群，37 °C孵育比30 °C孵育更快的生长和群扩张;然而，这些群体的形态往往随着温度的变化而变化。
   2. 对于延时成像，在将蜂群板转移到成像站之前，在适当的温度下孵育蜂群板（详见 表1 ）。
      注意： 这种预成像孵化允许群体在被转移到新环境之前开始发育并建立起来，这可能是也可能不是群体运动的最佳选择。

2. 表面运动测定的宏观成像

1. 对于延时成像，在预成像孵育期后，将群体测定板放在商业 体内 成像站内的透明成像板上。一次最多可成像六张直径为 60 毫米或四张直径为 100 毫米的板。由于相机从成像平面下方捕获图像，因此请倒置印版，以免光路被阻挡。或者，在实验期间在30°C或37°C（表1）下孵育，并以设定的时间间隔从培养箱中取出要成像的板。
2. 将培养皿的盖子直立放在装有接种培养基的板对应物的顶部。将培养皿的盖子装满水，以防止成像过程中过度干燥，并使用另一个透明托盘封闭整个装置，以在整个实验过程中保持湿度。
3. 使用分子成像（MI）软件，使用 表2中描述的成像设置在室温下运行测定。对于延时成像，请设置包含必要步骤和规范的协议。

表1：表面运动测定制备的规格。 包括 铜绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌和 黄棘支原体的表面运动测定制备规范。

	铜绿假单胞菌	铜绿假单胞菌卷须形成研究	枯草芽孢杆菌	黄花分枝杆菌
隔夜肉汤培养基	FAB 加 30 mM 葡萄糖	FAB 加 30 mM 葡萄糖	磅	CTT（复合介质）
过夜肉汤培养孵育温度	37 °C	37 °C	37 °C	30 °C 下 30 小时
群体媒体	晶圆厂	FAB 减号 （NH4）2SO4	2% （wt/vol） LB	铁通
群体介质：附加组件	12 mM 葡萄糖a	10%（wt / vol）豆酸（CAA），12mM葡萄糖a	不适用	SYTO® 64a
琼脂类型	琼脂，贵族	琼脂，贵族	颗粒琼脂	琼脂，Noble Affymetrix
琼脂浓度（wt/vol）	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
蜂群板大小	60 毫米	60 毫米	100 毫米	150 毫米
每板的介质体积	7.5 毫升	7.5 毫升	手工浇注	手工浇注
蜂群培养基设置/干燥方法	罩;未覆盖的板	罩;未覆盖的板	台式板覆盖	台式板覆盖
蜂群培养基设置/干燥时间	30 分钟	30 分钟	过夜（20 -24 小时）	过夜（20 -24 小时）
蜂群测定孵育温度	30 或 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
延时成像孵育	30 °C 至少 4 小时	30 °C 至少 4 小时	37°C，持续2小时	室温 12 小时
延时拍摄长度	24小时	24小时	10 小时	66 小时
延时设置	1 帧/10 分钟	1 帧/10 分钟	1 帧/6 分钟	1 帧/10 分钟
a 高压灭菌后添加。

 

表 2：成像规范。 布鲁克成像站规范，用于细菌表面生长的红色和绿色荧光和发光成像。

信号	绿色荧光	红色荧光 I	红色荧光 II	发光
蛋白质或染料	绿色荧光蛋白 （GFP）	mCherry 蛋白或尼罗河红鼠李糖脂染色剂	西托® 64	来自 勒克斯 纵子的荧光素酶
激发波长 （nm）	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	关闭
发射波长 （nm）	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	无过滤器
曝光时间（秒）	30	60	60	240
光圈值	4.0	4.0	2.5	1.1
视场角（毫米）	190	190	140	120
焦平面 （mm）	27.5	27.5	12.2	4
合并（像素）	没有	2 x 2	没有	8 x 8

材料