天蓝色链霉菌野生型与突变株的表型比较

摘要

来源：Bennett, J. A., et al.链霉菌发育突变体的显微观察与评估。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了野生型和突变型Streptomyces coelicolor菌株的培养及表型比较。视频介绍了减少自发突变、防止交叉污染以及通过正确涂布技术促进细菌生长的操作步骤。最后，通过菌落形态的视觉差异，阐明突变对细菌菌株发育造成的影响。

方案

1. 准备仪器、培养基、溶液和培养皿

1. 将牙签放入50 mL烧杯中，用铝箔覆盖后进行高压灭菌，以保持其无菌状态。

2. 在高压灭菌器中对所有将要使用的干燥物品（枪头、玻璃棒、玻璃器皿等）进行灭菌。

注意： 警告！请遵循所使用高压灭菌器型号的所有安全操作说明。高压灭菌器存在爆炸风险，可能导致蒸汽烫伤，以及接触高温表面、材料和培养基而造成伤害。

3. 准备用于培养菌种的MS琼脂（甘露醇大豆粉琼脂（SFM））。

1. 向1 L的烧瓶中加入5 g大豆粉和5 g琼脂。

2. 将5 g甘露醇溶解于250 mL自来水中，加入含有大豆粉和琼脂的烧瓶中。

3. 在烧瓶口添加泡沫塞和铝箔，于121 °C、15 psi条件下高压灭菌至少30分钟。

注意：该培养基极易沸腾溢出。请使用容量至少为实际MS琼脂体积四倍的锥形瓶进行高压灭菌。在安全注意事项相似的情况下，可用标准高压锅代替高压灭菌器。若无法使用高压灭菌器，也可使用微波炉对培养基和材料进行灭菌。高中教师还可考虑与当地高校合作，以获取经高压灭菌的实验用品。

4. 将培养基冷却至可安全操作的温度。注意不要冷却过久，因为琼脂在低于 50 °C 的温度下会凝固。

5. 将 MS 琼脂从烧瓶倒入无菌培养皿中，直至每个培养皿底部约半满（每培养皿约 25 mL 培养基）。待其凝固后方可使用琼脂平板。将琼脂平板置于塑料袋中，室温保存至使用前。

注意：琼脂平板也可保存在冰箱中，特别是当培养基中需要添加抗生素时。

2. 划线 链霉菌属 用于扩增的培养板

1. 使用标准方法（如四区划线法）将Streptomyces菌株在MS琼脂平板上划线至单菌落。

注意：可使用接种环或无菌牙签。可选：Streptomyces 菌种常用其他培养基，如 R2YE 培养基和最低培养基。

2. 在 30 °C 下孵育培养板。

3. 每隔 4–6 天挑取单个菌落重新划线接种平板。随着菌落老化，其发生随机突变的可能性增加。

3. 比较并记录外观特征

1. 在按照步骤2划线接种所有菌株后，观察并记录每种突变株相对于野生型亲本菌株的菌落形态。将新分离的菌株与已深入研究的物种进行比较，例如 S. coelicolor 或 S. venezuelae，当表征新 链霉菌属 物种。注意特征（图1）如基本形态、菌落表面（绒毛状、光滑、皱褶等）、透明度、隆起程度以及色素产生（区分营养菌丝、气生菌丝和/或周围培养基的色素）。

2. 标记一个MS琼脂平板，并以楔形模式划线接种野生型和突变株（图1）。注意各菌株之间不得接触，以防交叉污染。记录菌株接种到平板上的日期和时间。将平板在30 °C条件下培养。

3. 将培养好的培养皿放置在彩色或白色纸张上，以使背景均匀。在纸张上写明菌株名称、日期、培养温度以及首次划线接种后的时间。拍摄培养皿的数码照片，并将上述信息写在作为背景的纸张上，以尽量减少混淆。

注意：如果该照片将用于制备图示，其上的文字可在后续从照片中裁剪掉。

结果

图1：显示S. coelicolor宏观菌落表型的代表性琼脂平板照片。该琼脂平板展示了野生型S. coelicolor菌株MT1110（WT）气生菌丝的毛状灰白色外观，并与具有不同发育表型的多种随机转座子插入突变体进行对比。突变体或缺...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌水	GeneMate	G-3250-1L
牙签（扁平型）	Target	081-22-1957
移液器吸头（10 mL）	GeneMate	P-1240-10
移液器吸头（200 mL）	GeneMate	P-1240-200Y
移液器吸头（1,250 mL）	GeneMate	P-1240-1250
棉签	Fisherbrand	23-400-124
大豆粉	Bob's Red Mill	1516C164
D-甘露醇	Sigma-Aldrich	M4125-1KG
琼脂	Sigma-Aldrich	A1296-1KG
100% 甘油	VWR amresco life science	0854-1L
0.8% NaCl（生理盐水）	Sigma-Aldrich	SLBB9000V
培养皿	Sigma-Aldrich	P5856-500EA
盖玻片 #1.5	Thomas Scientific	64-0721
载玻片	Carolina	63-2010
高压灭菌器	Tuttnauer	2540E
镊子	Carolina Biological	624504
本生灯	Carolina Biological	706706
甲醇	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
PBS（磷酸盐缓冲液）	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
100 mL 烧杯	Pyrex USA	1000-T
1 L 烧杯	Carolina Biological	721253