相差显微镜用于评估发育突变体 链霉菌属

摘要

来源： Bennett, J. A. 等人 视觉与显微镜评估 链霉菌属 发育突变体 J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了利用相差显微镜观察野生型与突变型Streptomyces coelicolor之间表型差异的方法。视频概述了制备和成像气生菌丝的步骤，以检测孢子形成过程中的发育缺陷。

方案

1. 进行相差显微镜观察

1. 用70%乙醇清洗镊子，然后通过本生灯火焰灼烧以蒸发乙醇，进行灭菌。待其冷却。
2. 用70%乙醇清洗盖玻片，然后在无菌培养皿中晾干，以灭菌。
3. 制备待观察细菌生长的盖玻片印片。
   1. 用无菌镊子夹取一张无菌盖玻片，将其放置于甘露醇大豆粉（MS）琼脂平板上菌体生长密集的区域。Streptomyces coelicolor的孢子和气生菌丝充分转移至盖玻片上。轻轻按压镊子于盖玻片背面，以确保足够的菌体转移。
4. 从平板上取下盖玻片，将其带有细胞材料的一面朝下，覆盖在已滴有15 µL水配制的50%甘油封片液的显微镜载玻片上。将盖玻片以45°角接触载玻片，再缓缓放下，以减少气泡产生。
5. （可选）用透明指甲油封片，以保存样本。
6. 在生命周期的不同时间点进行相差显微镜观察。
   注意：重复成像可实现更完整的分析，并有助于检测发育延迟现象。应独立重复实验，以确保结果的准确性和可重复性。
   1. 将制备好的玻片置于显微镜载物台上，在盖玻片中央滴加一滴镜油。旋转至100X相差物镜，并将聚光镜转盘调至相应的“匹配”相差档位。物镜接触镜油后，仅使用微调旋钮对焦图像。
   2. 观察多个视野，以识别突变株与野生型之间明显且一致的差异，例如产孢能力、孢子大小与形态以及总体孢子数量（见图1）。
      注意：除相差显微镜外，还可选用微分干涉相差（DIC）显微镜，或使用亮视野显微镜配合简单染色技术，如结晶紫染色。

结果

图1：携带随机转座子插入突变的天蓝色链霉菌白色突变株代表性气生菌丝的相差显微照片。（A）显示的是经历同步、规律间隔细胞分裂的代表性野生型气生菌丝，产生形状和大小均匀的孢子（MT1110）。（B–F

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50% 甘油	Sigma-Aldrich	G5516
镜油（型号 DF）	Cragille	16482
无菌水	GeneMate	G-3250-1L
100% 乙醇	Sigma-Aldrich	E7023
大豆粉	Bob's Red Mill	1516C164
D-甘露醇	Sigma-Aldrich	M4125-1KG
琼脂	Sigma-Aldrich	A1296-1KG
100% 甘油	VWR amresco life science	0854-1L
培养皿	Sigma-Aldrich	P5856-500EA
盖玻片 #1.5	Thomas Scientific	64-0721
载玻片	Carolina	63-2010
相差显微镜	Olympus	BX40
镊子	Carolina Biological	624504
本生灯	Carolina Biological	706706
透明指甲油	OPI	22001009000
显微镜用相机	Olympus	DP72
腈类检查手套（中号）	Bio Excell	71011002