用于评估链霉菌发育突变体的相差显微镜

Abstract

资料来源：Bennett， J. A. et al.链霉菌发育突变体的视觉和显微镜评估。J. Vis. Exp.（2018年）

该视频演示了使用相差显微镜来检查野生型和突变型 Streptomyces coelicolor 之间的表型差异。它概述了制备和成像气丝以检测孢子形成发育缺陷所涉及的步骤。

Protocol

1. 进行相差显微镜检查

1. 通过用 70% 乙醇洗涤，然后通过本生灯火焰蒸发乙醇来对镊子进行消毒。让其冷却。
2. 通过用 70% 乙醇清洗盖玻片，然后让它们在无菌培养皿中干燥来对盖玻片进行消毒。
3. 准备要检查的细菌生长的盖玻片提升。
   1. 用无菌镊子拿起无菌盖玻片，并将盖玻片放在甘露醇大豆粉（MS）琼脂平板上，其中乳 糜链霉菌 细菌生长密集。用镊子轻轻按压盖玻片背面，以确保细菌孢子和气生菌丝体充分转移。
4. 从板上拿起盖玻片并将其放置，使细胞材料的一侧朝向显微镜载玻片的表面，并在水中制备 15 μL 50% 甘油滴以进行安装。通过将盖玻片与载玻片成 45° 角并让其落在 50% 甘油上来减少气泡。
5. （可选）用透明指甲油密封以保存载玻片。
6. 在生命周期内以不同的时间间隔进行相差显微镜检查。
   注意： 重复成像可以进行更完整的分析，并能够检测开发延迟。独立重复观察以确保准确性和可重复性。
   1. 将准备好的载玻片放在显微镜载物台上，并在盖玻片的中心加入一滴浸油。将 100X 相位物镜旋转到位，并将聚光镜转塔设置为正确的“匹配”相位设置。一旦物镜与油接触，仅使用微调旋钮对图像进行聚焦。
   2. 检查多个视野，以辨别突变菌株和野生型之间明显且一致的差异，例如形成孢子的能力、孢子大小和形状以及孢子总数（见 图 1）。
      注意： 相差显微镜的替代方案包括差分干涉对比 （DIC） 显微镜和与明场显微镜一起使用的简单染色技术，例如结晶紫染色。

Results

图1：相差显微照片显示了含有随机转座子插入突变的Streptomyces coelicolor白色突变株的代表性空中细丝。（A）所示为具有代表性的野生型气生细丝，它经历了同步的、规则间隔的细胞分裂，产生形状和大小均匀的孢子（MT1110）。（B-F）其余面板显示了通过随机转座子诱变分离的各种白色突变体的截然不同的微观表型。图

Materials