建立共生细菌与宿主细菌的二元共培养体系

摘要

来源：Collins, A. J., 等，建立口腔共生糖杆菌的稳定二元培养物。 J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了通过在宿主特异性生长培养基中依次共孵育，建立并维持一种共生菌（Saccharibacteria）及其宿主细菌的二元共培养体系。

方案

1. 通过离心浓缩Saccharibacteria细胞
   1. 在离心管和管盖上做一方向标记，将离心管放入高速离心机中，使标记朝上。离心后形成的沉淀通常不可见。标记有助于确定沉淀的位置。 Saccharibacteria 离心完成后，从离心机中取出离心管时，细胞所处的位置。
   2. 将样品在 60,000 x g 4 °C下孵育1小时。
      注意： 该离心力和时间足以沉淀所有Saccharibacteria细胞。然而，Saccharibacteria细胞在20,000 x g条件下离心仅20分钟即可实现至少部分沉淀。 g.
   3. 小心地从离心机中取出离心管。将管中的液体倒出，保留沉淀在管壁上侧。
   4. 将通常不可见的沉淀物用1-2 mL MRD（Maximal recovery diluent）缓冲液通过剧烈涡旋重新悬浮。

2. 用富集的糖杆菌门滤液感染宿主培养物

1. 在试管中分装 2 mL 适当的培养基（例如 TSBY（含 0.1% 酵母提取物的胰蛋白胨大豆肉汤）、BHI（脑心浸液）等），以准备培养管。
2. 向每根试管中加入 200 µL 宿主生物的过夜培养物。再向每根试管中加入 100–200 µL 重悬并过滤后的样品。
3. 根据宿主生物的需要，将混合样品在适宜条件下孵育（例如，Arachnia propionica 在 37 °C、有氧环境中孵育）。
4. 每两到三天传代一次，将 200 µL 二元培养物转移至新试管中含 2 mL 新鲜培养基的试管中。如果发现传代后的培养物无明显生长（即传代至新鲜培养基后，培养物的浑浊度/光密度未增加），则 Saccharibacteria 可能已过度增殖或杀灭了全部宿主生物。此时可在传代时加入 200 µL 未感染的宿主培养物以缓解该情况。至少连续传代 5 次。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑心浸出液肉汤（脱水粉末）	Becton-Dickinson	211059	或适用于目标生物的其他培养基
70-Ti 离心转子	Beckman Coulter	337922
2 型 Control InVitro 手套箱	Coy Laboratories	31615	如需用于微需氧生物时使用
Optima L-100 XP 高速离心机	Beckman Coulter	8043-30-1124
P-1000 微量移液器	Gilson	F123601G
P-200 微量移液器	Gilson	F123602G
PBS（磷酸盐缓冲液）	Fisher Scientific	BP399500
蛋白胨	Fisher Scientific	BP1420-500
移液器吸头 - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
移液器吸头 - 200 μL	Fisher Scientific	02-717-165
螺口锥形离心管 15 mL	Falcon	352096	或适用于细菌培养的其他管材
厚壁聚碳酸酯离心管（25 × 89 mm，容量 26.3 mL），带盖	Beckman Coulter	355618
胰蛋白胨大豆血琼脂平板	Northeast Laboratory Services	P1100	或足以支持宿主生物生长的其他琼脂平板
胰蛋白胨大豆肉汤（脱水粉末）	Becton-Dickinson	211825	或适用于目标生物的其他培养基
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-500