从琼脂培养物中传代培养亚硫酸盐还原厌氧菌

摘要

来源： Anwar, Z., 等富集与检测 产气荚膜梭菌 零售食品样品中的毒素型 J. Vis. Exp. (2019).

在本视频中，亚硫酸盐还原菌在含有亚硫酸盐的琼脂培养基中进行培养，它们在厌氧条件下生长，并将亚硫酸盐还原为硫化氢，与铁离子形成黑色沉淀。通过无菌操作技术从琼脂深层分离出黑色菌落，并转移至新鲜培养基中继续进行厌氧培养。

方案

注意：Clostridium perfringens 被列为生物安全等级2（BSL2）的生物体。尽管并非所有食品样本都含有C. perfringens，但所有培养样本均应按此级别处理。操作过程中应始终采取适当的预防措施并穿戴个人防护装备（PPE）。所有材料在丢弃前必须进行去污处理。

1. 准备改良的RPM（梭状芽孢杆菌快速培养基）

1. 在去离子水中加入30 g/L流体硫乙醇酸盐培养基、60 g/L明胶、5 g/L蛋白胨、5 g/L葡萄糖、5 g/L磷酸氢二钾、3 g/L酵母提取物、1.5 g/L氯化钠、0.5 g/L硫酸亚铁，搅拌至均匀分散。我们通常配制1 L的批次。
2. 在121 °C下高压灭菌15分钟。
3. 冷却至约40 °C。
4. 待RPM冷却后，加入D-环丝氨酸，使其终浓度为440 mg/L。
   注意：将D-环丝氨酸溶于无菌水配制成50 mg/mL的储存液，可于-20 °C保存以供后续使用。
5. 无菌条件下将10 mL RPM转移至15 mL锥形管中。RPM可批量制备，并在4 °C保存最多一个月。
6. 使用前将RPM预热至37 °C。

2. 样品采集与RPM孵育

1. 在1小时内将食品在常温下运送至实验室。食品可置于原始包装或无菌容器中运输。若不能立即检测，可将样品储存于-20 °C直至使用。如条件允许，应根据包装标签记录食品类型及原产国，以及其他任何相关信息。
2. 取约1.0–2.0 g食品样品，转移至无菌培养皿或等效容器中，用无菌剃刀或解剖刀将其切碎。
3. 将样品接种于15 mL锥形管中的10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分混匀。
   1. 为筛选营养细胞，取5 mL PBS-食品混合液转移至另一含有10 mL RPM培养基的15 mL锥形管中，拧紧管盖。
   2. 为筛选芽孢，将剩余的5 mL PBS-食品混合液于85 °C加热15分钟，随后转移至含有10 mL RPM培养基的15 mL锥形管中，拧紧管盖。
4. 对食品-RPM培养物进行涡旋振荡并反复倒置，确保充分混匀。
5. 将锥形管管口密封严密，并用石蜡膜或塑料封口膜包裹管盖，以确保厌氧环境。
6. 在37 °C条件下过夜（ON）培养。
7. 次日早晨，观察RPM管中是否存在浑浊或发酵现象。

3. TSC（胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸）“夹层”涂布法

1. 使用下述的“三明治”技术（图1）将过夜RPM培养物接种至TSC琼脂中。
2. 按照生产商说明书配制TSC琼脂。
   1. 通过将10 mL熔融TSC琼脂转移至无菌培养皿中并使其凝固，制备TSC平板的底层。该步骤可提前准备，并于4 °C保存。使用前确保平板恢复至室温。
   2. TSC平板的上层使用剩余的熔融TSC琼脂，需维持在40 °C。
      注意： 尽管琼脂的熔点高于85 °C，但熔融琼脂在约32–45 °C时会凝固。
3. 小心取出过夜RPM培养物，并转移100 µL至TSC琼脂底层。由于发酵作用，部分培养物可能处于加压状态。操作时务必穿戴所有适当的个人防护装备（PPE）。
4. 使用灭菌的玻璃珠或涂布棒将RPM接种物均匀涂布。
5. 在室温下静置5–10分钟，使RPM被TSC琼脂“吸收”。
6. 使用移液管小心地将20 mL熔融、40 °C的TSC琼脂转移至平板中。
7. 盖上培养皿盖，在室温下静置直至TSC琼脂完全凝固。
8. 将培养皿倒置，在37 °C下过夜培养。
9. 若需进行连续稀释，可在接种至TSC琼脂前，将过夜RPM培养物用新鲜且预热的RPM进行稀释。

4. 亚培养亚硫酸盐还原菌落

1. 次日早晨，从培养箱中取出培养皿，检查细菌生长情况。需氧菌可能生长在琼脂表面，厌氧菌则会嵌入琼脂内部生长。产硫化物还原的细菌会使周围琼脂变为黑色。可能 C. perfringens 菌落呈黑色并嵌入琼脂中。
2. C. perfringens 可疑菌落会呈现亚硫酸盐还原阳性，菌落呈黑色，嵌于琼脂内部。使用无菌一次性滴管，从琼脂中“挑取”黑色菌落，并转移至含有10 mL新鲜RPM培养基的15 mL锥形管中。在刺入琼脂前，务必先排出滴管内的空气。
3. 如果平板表面有大量需氧细菌生长，请使用无菌细胞刮刀从选定区域刮取菌落。多个 C. perfringens- 可从同一TSC平板上挑取疑似菌落，分别接种于RPM培养基中进行培养。
4. 紧密固定锥形管管盖，并用石蜡膜或塑料封口膜包裹。在 37 °C 下孵育过夜。

结果

图1：TSC琼脂三明治技术示意图。

为了促进厌氧环境，将含有 C. perfringens 细菌的RPM培养基接种在两层TSC琼脂之间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
D-环丝氨酸	Sigma-Aldrich	C6880
葡萄糖	Sigma生命科学	D9434-250G
一次性移液管	任何品牌		选择尖端较细的移液管，例如 Thermo Scientific 一次性转移移液管 137116M/EMD
DNeasy 血液 & 组织试剂盒	Qiagen	69504	注意：已评估多种DNA和质粒提取试剂盒，该试剂盒获得的结果最为理想。
干式培养箱	任何品牌
流体硫乙醇酸盐培养基	Remel	R453452
猪皮明胶	Sigma生命科学	G1890-500G
七水合硫酸亚铁	Sigma生命科学	F8633-250 G
来自鸡蛋清的溶菌酶	Sigma-Aldrich	L6876	DNA提取所需，但试剂盒中未提供
Parafilm 或塑料薄膜	任何品牌
酪蛋白及其他动物蛋白胨	Sigma-Aldrich	70173-100G
Perfringens 琼脂基础（TSC + SFP）	Oxoid	CM0587	根据说明书制备TSC琼脂
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	P2222-100G
氯化钠	Sigma-Aldrich	S-7653
无菌细胞刮刀	任何品牌
无菌细胞涂布棒	任何品牌
无菌培养皿	任何品牌
酵母提取物	Sigma-Aldrich	70161-100G