基于薄层色谱法分离从应激诱导的细菌中分离的 （p）ppGpp 核苷酸

Abstract

资料来源：Fernández-Coll， L. 和 Cashel， M. 使用微量滴定皿放射性标记对大肠杆菌 （p）ppGpp 进行多次体内测量，然后进行薄层色谱法。J. Vis. Exp.（2019年）

该视频介绍了一种高通量方案，用于使用薄层色谱（TLC）测量细菌应激反应核苷酸ppGpp和pppGpp的水平和动力学。该方法提供了一种强大、快速且经济高效的方法来定量各种胁迫条件下细菌培养物中的 （p）ppGpp，从而能够对细菌生理学和严格反应进行高分辨率分析。

Protocol

1. 薄层色谱
   1. 用软铅笔在距 20 cm x 20 cm 聚乙烯胺-纤维素 （PEI-纤维素） 薄层色谱 （TLC） 板边缘 1 cm 处标记原点线，该板已用剪刀从顶部取下 5 cm。将 5 μL 作为液滴滴涂抹在每个样品的 PEI 表面上。在不让该斑点干燥的情况下开始上升显影，这可以通过最大限度地减少条纹来提高分辨率。
   2. 在具有一层 1.5 M KH₂PO₄ （pH 3.4） 溶液的罐中进行升序显影，该溶液足够浅，使液体不会接触原点样品点。用气密密封盖住水箱，让液体上升到修剪过的纸张的顶部，15 厘米。为了使 1.5 M KH₂PO₄ 溶液达到 pH 3.4，需要通过添加 H₃PO₄ 来调节 pH 值。
   3. 取出完全显影的色谱图，并在室温下风干。
   4. 将含有游离 ³²P 的色谱图的顶部（pH 前）部分切割并丢弃到放射性废物中。该部分在 图 1 中以黄色表示，在紫外光下很容易可视化。如果仅测量迁移速度比三磷酸鸟苷（GTP）慢的（p）ppGpp核苷酸，建议运行紫外可见GTP标准品，然后切割并丢弃更大的上部（任何高于GTP的，如 图1所示）。
   5. 用荧光粉屏幕曝光放射自显影胶片过夜。
   6. 冲洗胶片。使用磷光成像仪捕获和定量荧光粉屏幕信号。
       
2. （p）ppGpp的定量
   1. 使用图像 J 定量放射性斑点。
      注意： （p）ppGpp的量可以归一化为每个样品中观察到的G核苷酸总量（图1）。如果背景量均匀，则可以减去单个空白（ 图 1 中的方框 4）以校正背景。总 G 是检测到 GTP + ppGpp + pppGpp 的总和。这种归一化假设一磷酸鸟苷 （GMP） 和二磷酸鸟苷 （GDP） 水平可以忽略不计，这对于 大肠杆菌来说是正确的。给定核苷酸与总 G 的比率提供了一种重要的方法来校正应用样品体积的变化。

Results

图 1：代表性 TLC 分析。 使用 TLC 进行放射自显影和荧光粉筛选过夜后获得的结果示意图。要测量的点以红色显示。还显示了计算 ppGpp 分数量的公式。总G是指样品中检测到的GTP+ppGpp+pppGpp的总量。黄色带代表紫外线下可见的pH值前沿。剪刀指示我们建议在何处切割色谱图以丢弃大部分放射性。箭头表示使用 1.5 M 磷酸盐缓冲液进行上行发育过程中的流动方向

Materials