基于薄层色谱法分离应激诱导细菌中提取的(p)ppGpp核苷酸

摘要

来源： Fernández-Coll, L. 和 Cashel, M. 利用微量滴定板放射性标记结合薄层色谱法对大肠杆菌（Escherichia coli）中 (p)ppGpp 进行多项活体测定。J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了一种利用薄层色谱法（TLC）高通量检测细菌应激反应核苷酸 ppGpp 和 pppGpp 水平及其动态变化的实验方案。该方法能够快速、经济且高效地定量分析在不同应激条件下细菌培养物中的 (p)ppGpp 水平，从而实现对细菌生理状态及严谨反应的高分辨率研究。

方案

1. 薄层色谱法
   1. 用软铅笔在20 cm × 20 cm的聚乙烯亚胺-纤维素（PEI-纤维素）薄层色谱（TLC）板边缘1 cm处画一条起始线，该色谱板顶部已用剪刀剪去5 cm。每个样品在PEI表面点样5 µL，以液滴形式点样。点样后立即开始上行展开，不要让斑点干燥，以减少拖尾现象，提高分辨率。
   2. 在展开槽中进行上行展开，槽内加入1.5 M KH₂PO₄（pH 3.4）溶液，液层深度应足够浅，确保液体不接触起始线上的样品点。用密封盖封闭展开槽，使液体沿剪裁后的色谱板上升至顶端（15 cm）。为配制pH 3.4的1.5 M KH₂PO₄溶液，需通过加入H₃PO₄调节pH值。
   3. 取出完全展开的色谱图，在室温下空气中干燥。
   4. 将含有游离³²P的色谱图顶部（pH前沿）部分剪下并作为放射性废物丢弃。该部分在图1中以黄色表示，在紫外光下易于观察。若仅检测迁移速度慢于三磷酸鸟苷（GTP）的(p)ppGpp核苷酸，建议同时运行紫外-可见GTP标准品，然后剪除并丢弃更大的上部区域（即GTP以上的全部区域，如图1所示）。
   5. 将放射自显影胶片与磷屏一起曝光过夜。
   6. 显影胶片。使用磷屏成像仪捕获并定量磷屏信号。
      
2. (p)ppGpp的定量分析
   1. 使用Image J软件对放射性斑点进行定量。
      注意： (p)ppGpp的量可归一化为各样品中观察到的总G核苷酸量（图1）。若背景信号均匀，可统一减去一个空白区域（图1中的4号框）以校正背景。总G为检测到的GTP、ppGpp和pppGpp之和。此归一化方法假设单磷酸鸟苷（GMP）和二磷酸鸟苷（GDP）的含量可忽略不计，这在Escherichia coli中成立。特定核苷酸与总G的比值可有效校正加样体积的差异。

结果

图1： 代表性薄层色谱（TLC）分析。 显示在薄层色谱后经放射自显影和磷屏过夜曝光所获得结果的示意图。需测量的斑点以红色标出。图中同时给出了计算ppGpp相对含量的公式。Total G指样品中检测到的GTP + ppGpp + pppGpp的总量。黄色条带代表在紫外光下可见的pH前沿。剪刀图标指示...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
放射自显影胶片	Denville scientific inc.	E3218
储存式磷屏	Kodak	So230
薄层色谱 PEI 纤维素 F	Merk-Millipore	1.05579.0001
Typhoon 9400 成像仪	GE Healthcare
KH₂PO₄	Fisher Biotech	BP362-500
H₃PO₄	J.T.Baker	0260-02