巨囊泡内细菌的单细胞培养

摘要

来源：Morita, M., 等．巨型囊泡内单细胞水平的细菌细胞培养．J. Vis. Exp. （2019）．

本视频展示了一种用于培养和观察单个细菌细胞的方法，这些细菌细胞被包裹在锚定于支撑脂双层上的巨型囊泡内。该系统可在受限且具有生理相关性的微环境中，实现对单细胞生长动态的稳定、长期成像。

方案

1. 巨型囊泡（GV）观察系统（细菌培养系统）的制备

1. 用于构建支撑双层膜的小囊泡（SVs）的制备
   1. 将20 μL POPC（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）溶液和4 μL生物素-PEG-DSPE（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[生物素基（聚乙二醇）-2000]）溶液加入玻璃试管中。
   2. 通过气流蒸发有机溶剂以形成脂质膜，并将样品置于干燥器中1小时，彻底去除残留有机溶剂。
   3. 向玻璃小瓶中加入200 μL含200 mM葡萄糖的1x LB（Luria-Bertani肉汤）培养基（GVs的外水相溶液）。
   4. 用封口膜包裹玻璃小瓶开口，并在超声水浴（120 W）中处理至少1小时。
   5. 使用微型挤出器和孔径为100 nm的聚碳酸酯膜，通过挤出法获得小囊泡（SVs）。
2. 自制样品腔室的制备
   1. 使用空心打孔器在双面密封垫（10 mm × 10 mm × 1 mm）上钻一个直径为7 mm的孔。
   2. 将带孔的双面密封垫粘贴到盖玻片（30 mm × 40 mm，厚度0.25–0.35 mm）上。
3. 在腔室孔洞内的盖玻片表面制备支撑双层膜
   1. 向腔室孔洞（按步骤2.2制备）中加入30 μL SV溶液，在室温下孵育30分钟。
   2. 用移液器吸取20 μL含200 mM葡萄糖的1x LB培养基（GVs的外水相溶液），轻轻冲洗孔洞两次。
4. 将GVs固定在腔室孔洞内盖玻片上的支撑双层膜上
   1. 向孔洞中加入10 μL含中性亲和素（neutravidin）的GVs外水相溶液（1 mg/mL），在室温下孵育15分钟。
   2. 用移液器吸取20 μL含200 mM葡萄糖的1x LB培养基（GVs的外水相溶液），轻轻冲洗孔洞两次。
   3. 将全部含GVs的溶液加入腔室孔洞中，并用盖玻片（18 mm × 18 mm，厚度0.13–0.17 mm）密封（图1b）。
5. 观察GVs内细菌细胞的生长情况
   1. 将倒置显微镜配备40x/0.6数值孔径（NA）长工作距离物镜，并连接显微加热台系统（图1b）。
   2. 将腔室置于显微加热台系统上（图1b），在37 °C静态条件下孵育6小时，使GVs内的细菌细胞生长。
   3. 使用科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机，每30分钟拍摄并记录GVs内细菌细胞生长的显微图像。

结果

图1：GVs内细菌细胞培养的观察系统。 （a）GVs通过盖玻片上的生物素–链霉亲和素结合固定在支撑膜上。GVs由加热系统进行孵育。（b）观察系统的实物图，包括一个自制的腔室。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨	BD Biosciences	211705
氯仿	Wako Pure Chemicals	032-21921
盖玻片（18 × 18 mm）	Matsunami Glass Ind.	C018181	厚度 0.13–0.17 mm
盖玻片（30 × 40 mm）	Matsunami Glass Ind.	定制	厚度 0.25–0.35 mm
台式离心机	Hi-Tech Co.	ATT101	摆动转子型
双面密封垫（10 × 10 × 1 mm）	Nitoms	T4613
葡萄糖	Wako Pure Chemicals	049-31165
倒置显微镜	Olympus	IX-73
甲醇	Wako Pure Chemicals	133-16771
显微镜加热载物台系统	TOKAI HIT	TP-110R-100
矿物油	Nacalai Tesque	23334-85
中性亲和素	Thermo Fisher Scientific	31000
物镜	Olympus	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
聚碳酸酯膜	Avanti Polar Lipids	610005
sCMOS 相机	Andor	Zyla 4.2 plus	孔径 100 nm
氯化钠	Wako Pure Chemicals	191-01665
蔗糖	Wako Pure Chemicals	196-00015
超声波清洗机	AS ONE	ASU-3D
酵母提取物	BD Biosciences	212750
0.6 mL 带盖塑料管	Watson	130-806C
1.5 mL 带盖塑料管	Sumitomo Bakelite Co.	MS4265-M
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱	Avanti Polar Lipids	850457P
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)-2000]	Avanti Polar Lipids	880129P	POPC
			生物素-PEG-DSPE