利用乙烯释放化合物研究细菌对乙烯的响应

摘要

来源：Augimeri, R. V. 等，利用乙烯释放化合物2-氯乙基膦酸作为研究细菌乙烯响应的工具。J. Vis. Exp. （2016）

本视频展示了2-氯乙基膦酸（CEPA）产生的乙烯对细菌生长和纤维素合成的影响。乙烯可激活促进纤维素合成的信号通路，从而增强菌膜的形成。这些结果揭示了细菌对乙烯的响应机制。

方案

1. 菌膜测定
   1. 三重培养并定量Komagataeibacter xylinus起始菌液：
      1. 取单个Komagataeibacter xylinus菌落，分别三份接种于5 ml添加了0.2%（v/v）过滤除菌纤维素酶的Schramm-Hestrin（SH）培养基（pH 5）中。在30 °C、150 rpm振荡条件下培养，直至600 nm处光密度（OD₆₀₀）达到0.3至0.4（约72小时）。
      2. 通过离心（2,000 × g；4 °C；10分钟）收集起始菌液，用5 ml无菌生理盐水洗涤细胞两次，并重悬菌体沉淀。将细胞置于冰上保存。
      3. 使用Petroff-Hausser计数板对细胞进行定量。
   2. 制备接种用母液以接种24孔板：
      1. 向60 ml SH培养基（pH 7）中分别加入120 µl浓度为5、50和500 mM的2-氯乙基膦酸（CEPA）储备液，使最终CEPA浓度分别为0.01、0.1和1.0 mM。另取60 ml SH培养基（pH 7）加入120 µl用于溶解CEPA的溶剂作为对照。涡旋混匀。
      2. 将每种含CEPA的60 ml培养基分成四份，每份14 ml。将其中三份14 ml培养基分别接种起始菌液的三个生物学重复样本，接种浓度为10⁵ cells/ml。将含细胞的试管置于冰上，以防止纤维素生成。
         注意：剩余的一份14 ml培养基用于无菌对照孔。
   3. 接种24孔板：
      1. 每种处理单独使用一块板，每板设置三行生物学重复和一行无菌对照（图1）。
      2. 使用14 ml母液，向无菌24孔板中的每个孔加入2 ml。完成三个生物学重复及无菌对照的加样（图1）。每种处理均重复此步骤。
      3. 用石蜡膜密封板，于30 °C静置培养7天。
      4. 收集并测定菌膜干重（纤维素产量）（图1）：
         1. 将菌膜分别转移至6孔板的各孔中。为裂解细胞，加入12 ml 0.1 N氢氧化钠（NaOH），80 °C处理20分钟。
         2. 去除NaOH后，用超纯水振荡洗涤菌膜24小时以中和残留碱液，每6小时更换一次水。
            注意：洗涤完成后菌膜应呈白色。
         3. 将菌膜置于硅胶垫上，50 °C干燥48小时至恒重。干燥后从垫上取下，用分析天平称重，以确定细菌纤维素产量。

结果

图1：展示用于菌膜检测与分析的实验流程图。将60 ml含CEPA补充剂的pH 7 SH培养基母液分装为三份独立的生物学重复接种样本及一份无菌对照样本（每份14 ml）。随后将这些培养物各取2 ml分装至24孔板中，设置六个技术重复，并用石蜡膜密封。在30 °C下培养7天后，收集菌膜并通过测定湿重、厚度、干重以及傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析结晶度对其进行表征。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
来自Trichoderma reesei ATCC 26921 的纤维素酶	Sigma	C2730	水溶液
柠檬酸	BioShop	CIT002.500	用于 SH 培养基
乙烯利（≥ 96%；2-氯乙基膦酸）	Sigma	C0143	释放乙烯的化合物
葡萄糖	BioBasic	GB0219	用于 SH 培养基
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582	ATCC	53582	产细菌纤维素的α-变形菌
磷酸氢二钠七水合物	BioShop	SPD579.500	用于 SH 培养基的磷酸氢二钠七水合物
NaCl	BioBasic	SOD001.1	用于生理盐水和对照溶液的氯化钠
磷酸二氢钠一水合物	BioShop	SPM306.500	用于对照溶液的磷酸二氢钠一水合物
NaOH	BioShop	SHY700.500	用于 pH 调节的氢氧化钠
石蜡膜	Parafilm	PM996	用于密封培养板和烧瓶
蛋白胨（细菌学用）	BioShop	PEP403.1	用于 SH 培养基
Petroff-Hausser 计数室	Hausser scientific	3900	细菌细胞计数室
聚醚砜灭菌滤膜 0.2 µm	VWR	28145-501	用于纤维素酶的灭菌过滤
酵母提取物	BioBasic	G0961	用于 SH 培养基