在细菌宿主中扩增自杀质粒

摘要

来源：Tomás, J. M., 等. 利用空突变体解析细菌糖基转移酶在细菌运动性中的作用。 J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了在E. coli中依赖起始蛋白的自杀性质粒的扩增过程。该质粒携带抗生素抗性基因，仅在宿主编码的起始蛋白存在时才能复制。经过电穿孔并置于恢复培养基中孵育后，将混合物涂布于含有抗生素的琼脂平板上。含有质粒的细菌能够存活，因为其起始蛋白可启动质粒上抗生素抗性基因的表达。

方案

1. 鞭毛糖基化岛基因的无效突变体构建

注意：该诱变方法基于利用自杀载体 pDM428（GenBank：KC795686.1）进行聚合酶链式反应（PCR）的同框缺失产物的等位基因交换。pDM4 载体的复制依赖于 lambda pir，并通过利用位于载体上的 sacB 基因强制实现完整的等位基因交换。

1. PCR框内缺失产物的构建。
   1. 设计两对引物，分别扩增待删除基因或区域上游（A 和 B 引物）和下游（C 和 D 引物）的 DNA 片段图1B).
   2. 确保引物A和引物D分别在待敲除基因的起始位点上游和终止位点下游至少包含600 bp的序列。这两个引物的5'端需引入一个限制性内切酶的酶切位点，该酶切位点可用于在pDM4载体中进行克隆。
      注意A 和 D 引物5'端包含的限制性酶切位点不应与 AB 或 CD 扩增子内部的位点相同。
   3. 确保引物B和引物C分别位于待删除的基因内部，或位于待删除区域的第一个和最后一个基因内部。确保两个引物（B和C）均处于正确的读码框内，并位于基因内部5-6个密码子之间。此外，确保两个引物在5'端均包含一段21 bp的互补序列表1）可实现DNA扩增子AB与CD的连接。
   4. 培养所选菌株 气单胞菌属 在30℃下于5 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中过夜（O/N）培养菌株 °C. 使用市售的基因组DNA纯化试剂盒，并按照生产商的说明书进行操作（材料表). 定量 2 µ使用分光光度计测定纯化后 DNA 的 L 值。
      注意：以双蒸水作为空白对照，将仪器设置为在 260 nm 处记录吸光度。用 2 µ纯化DNA的L值重复测定3-5次，计算平均吸光度读数。利用比尔-朗伯定律计算DNA浓度，公式为A = Ɛ·c·l，其中“A”代表吸光度，“Ɛ”为DNA的摩尔平均消光系数，“c”为DNA浓度，“l”为光程长度（具体数值请参考各仪器制造商的使用说明）。
   5. 使用100 ng纯化的染色体DNA作为模板，分别用A-B引物和C-D引物进行两组不对称PCR材料表). 使用10:1的A:B与D:C引物对摩尔比。
      注意不对称PCR能够优先扩增模板的一条链，而非另一条链。
   6. 通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。使用TAE（40 mM Tris-乙酸盐，1 mM乙二胺四乙酸（EDTA））作为凝胶电泳缓冲液，电泳条件设置为8 V/cm。为观察DNA，加入溴化乙锭（0.5 µg/mL）加入凝胶中，并使用生物成像仪观察PCR产物（材料表).
   7. 用手术刀从凝胶中切下扩增子，按照制造商的说明书进行纯化（材料表，并对它们进行定量。
   8. 通过PCR产物3'端的21 bp重叠序列连接AB和CD扩增子（图2). 在PCR管中将每种扩增子（AB和CD）各100 ng与PCR试剂（预AD PCR）混合，不加引物，使用PCR仪程序进行延伸。然后加入100 µ将A和D引物（AD PCR）加入反应体系，扩增为单一片段。
   9. 使用1.1.6步骤中所述条件，通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物（AD扩增子），从凝胶中切下扩增子，按照试剂盒生产商的说明书进行纯化，并对扩增子进行定量（材料表).
2. 构建带有框内缺失的pDM4重组质粒
   1. 过夜培养一种培养物 大肠杆菌 cc18λ pir 含有pDM4质粒的氯霉素（25 μg/mL）Luria-Bertani（LB）Miller液体培养基（10 mL） µg/mL）在30 °C.
   2. 在 5,000 x g 条件下离心培养物 g 4 ℃时 °C，将沉淀重悬于600 µ无菌去离子水。使用市售质粒提取试剂盒，按照供应商提供的说明提取和纯化质粒pDM4。材料表).
   3. 消化 1 µpDM4 的克隆位点和 AD 扩增子两端均可被一种内切酶在 2 小时内消化，使用 400 ng AD 扩增子图2）。按照酶制造商提供的说明书设置反应条件（材料表).
   4. 使用DNA纯化试剂盒纯化经消化的质粒和扩增产物，并根据制造商说明书进行定量（材料清单).
   5. 为防止线性化pDM4质粒重新连接，按照碱性磷酸酶试剂生产商的说明书，使用碱性磷酸酶去除两端5'端的磷酸基团（材料表）。然后，纯化经处理的质粒，并使用分光光度计按照步骤1.1.4所述方法进行定量（材料表).
   6. 将150 ng经消化并用碱性磷酸酶处理的pDM4载体与95–100 ng经消化的AD扩增片段按1:4的摩尔比（载体:插入片段）混合，总体积为15 μL进行连接反应。 µL，按照制造商的说明（材料表).
   7. 20℃孵育过夜 °C 或在4°C下过周末 °C. 孵育后，在70℃下灭活T4连接酶 °20 分钟，C
   8. 使用连接反应将质粒导入 大肠杆菌 MC1061λpir 通过电穿孔转化菌株。使用电转感受态细菌和2 mm间隙的电穿孔比色皿。
3. 电转感受态细胞的制备 E. coli 以及pDM4重组质粒的电转化
   1. 接种单个菌落 E. coli MC1061λpir 转移到Luria-Bertani（LB）Miller液体培养基中，30℃过夜培养 °37°C，200 rpm 振荡培养。
   2. 将2 mL细菌培养物稀释于18 mL LB肉汤中，并在30 ℃下培养 °37°C 摇床（200 rpm）培养，直至光密度（OD600）达到 0.4–0.6。
   3. 通过在 5,000 x g 条件下离心收集菌体 g 和 4 °C 下孵育 15 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 40 mL 冰冷的蒸馏 H₂O.
   4. 再重复此清洗步骤两次，以去除所有培养盐。最后，将沉淀重悬于4 mL预冷的蒸馏H₂O，并将1 mL悬浮液转移至四个锥形1.5 mL微量离心管中。
   5. 通过离心（14,000 x g）沉淀细菌培养物 g 和 4 °C 下 5 分钟。弃去上清液，不要扰动沉淀，将每份沉淀重悬于 100 µ冰冷的蒸馏水 L₂O.
   6. 加入3-3.5 µ将连接混合物各 L 加入每支试管，冰上孵育 5 分钟。随后，将每支试管中的内容物转移至预冷的 2 mm 间隙电穿孔比色皿中，施加 2 kV、129 Ω，时间常数约为 5 ms。
      注意：将电穿孔比色皿预先放在冰上冷却。整个操作过程中始终保持细菌处于冰上。
   7. 电穿孔后，加入250 µ向四个比色皿中各加入适量 SOC（含分解代谢物阻遏的超级优化肉汤）培养基以重悬菌体，转移至一支培养管中（总体积约1 mL），于30 °C孵育1小时 °C，振荡（200 rpm）。
   8. 将转化后的细胞接种于添加氯霉素（25 μg/mL）的LB（Luria-Bertani）琼脂平板上 µg/mL) 以确保平板上生长的所有菌落均含有质粒骨架。

表1：用于构建空突变体的引物。引物B和C中的重叠区域已加下划线。引物A和D中的BamHI位点以粗体显示。

引物名称	5’至3’方向序列	用于
A. piscicola AH-3
A-Flgi1	CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA	fgi 突变体
B-Flgi1	CCCATCCACTAAACTTAAACAGATCACCTCGAACTCGAAA
C-Flgi12	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGGAACCTTAAATGCCATGA
D-Flgi12	CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-Flgi1	ACCCGCTTCATTCGCTAT
F-Flgi12	TCCGATTTTCTGACTCAGGG
A-Fgi4	CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA	fgi-4 突变体
B-Fgi4	CCCATCCACTAAACTTAAACACATATTATCTTGCCCCTGAT
C-Fgi4	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGATGGAGCTAATCACTCGTTT
D-Fgi4	CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
E-Fgi4	ATTTCCCTGCCAAATACG
F-Fgi4	CCTGCCAACAGGATGTAAG
pDM4 载体
pDM4for	AGTGATCTTCCGTCACAGG	pDM4 载体的插入
pDM4rev	AAGGTTTAACGG TTGTGGA

结果

图1：染色体区域的生物信息学检测与引物设计。 （A）在嗜水气单胞菌AH-1和鱼毒性气单胞菌AH-3中鉴定出的染色体区域示意图。嗜水气单胞菌AH-1的鞭毛糖基化岛代表仅含有拟唾液酸衍生物作为鞭毛糖的菌株，而鱼毒性气单胞菌AH-3的鞭毛糖基化岛则代表鞭毛糖为杂多糖的菌株。黑色标注的基因为参与拟唾液酸生物合成的基因，黄色标注的基因为推测的糖基转移酶（GTs）。（B）用于PCR同框缺失的引物对在染色体上的位置示意图。A和D引物中的蓝色框包含内切酶的限制性结合位点，B和C引物中的红色框包含21个碱基的互补序列。

图2：展示构建PCR同框缺失并连接至自杀质粒pDM4的方法示意图。MCS：多克隆位点，CmR：氯霉素抗性基因，sacB：编码枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶，其表达受蔗糖诱导，对革兰氏阴性菌具有致死作用，mob：移动化基因。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 循环测序即用反应试剂盒	Applied Biosystems	4337455	用于测序
AccuPrime Taq DNA 聚合酶，高保真	Invitrogen	12346-086	用于扩增 AB、CD 和 AD 片段
琼脂糖	Conda-Pronadise	8008	用于 DNA 电泳
碱性磷酸酶，小牛肠（CIAP）	Promega	M1821	用于去除 5’ 端的磷酸基团
Bacto 琼脂	Becton Dickinson	214010	用于运动性分析
BamHI	Promega	R6021	用于内切核酸酶限制性酶切
BglII	Promega	R6081	用于内切核酸酶限制性酶切
BioDoc-It 成像系统	UVP		用于 DNA 可视化的生物成像系统
Biotaq 聚合酶	Bioline	BIO-21040	用于菌落筛选
Cytiva illustra GFX PCR DNA 及凝胶条带纯化试剂盒	Cytivia	28-9034-71	用于 PCR 扩增产物和 DNA 片段的纯化
EDTA	Applichem	131026.1211	用于 DNA 电泳
电穿孔比色皿，2 mm 间隙	VWR	732-1133	用于转化
LB（Luria-Bertani）Miller 琼脂	Condalab	996	用于 Escherichia coli 培养
LB（Luria-Bertani）Miller 肉汤	Condalab	1551	用于 Escherichia coli 培养
Nanodrop ND-1000	NanoDrop Technologies Inc		用于 DNA 定量的分光光度计
利福平	Applichem	A2220,0005	用于三亲交配
SOC 培养基	Invitrogen	15544034	用于电穿孔后的细胞恢复
T4 DNA 连接酶	Invitrogen	15224017	用于连接反应
Veriti 96 孔梯度 PCR 仪	Applied Biosystems		用于 PCR 反应