在细菌宿主中扩增自杀质粒

摘要

来源：Tomás, J. M., 等. 利用空突变体解析细菌糖基转移酶在细菌运动性中的作用。 J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了在E. coli中依赖起始蛋白的自杀性质粒的扩增过程。该质粒携带抗生素抗性基因，仅在宿主编码的起始蛋白存在时才能复制。经过电穿孔并置于恢复培养基中孵育后，将混合物涂布于含有抗生素的琼脂平板上。含有质粒的细菌能够存活，因为其起始蛋白可启动质粒上抗生素抗性基因的表达。

方案

1. 鞭毛糖基化岛基因的无效突变体构建

注意：该诱变方法基于利用自杀载体 pDM428（GenBank：KC795686.1）进行聚合酶链式反应（PCR）的同框缺失产物的等位基因交换。pDM4 载体的复制依赖于 lambda pir，并通过利用位于载体上的 sacB 基因强制实现完整的等位基因交换。

1. PCR框内缺失产物的构建。
   1. 设计两对引物，分别扩增待删除基因或区域上游（A 和 B 引物）和下游（C 和 D 引物）的 DNA 片段图1B).
   2. 确保引物A和引物D分别在待敲除基因的起始位点上游和终止位点下游至少包含600 bp的序列。这两个引物的5'端需引入一个限制性内切酶的酶切位点，该酶切位点可用于在pDM4载体中进行克隆。
      注意A 和 D 引物5'端包含的限制性酶切位点不应与 AB 或 CD 扩增子内部的位点相同。
   3. 确保引物B和引物C分别位于待删除的基因内部，或位于待删除区域的第一个和最后一个基因内部。确保两个引物（B和C）均处于正确的读码框内，并位于基因内部5-6个密码子之间。此外，确保两个引物在5'端均包含一段21 bp的互补序列表1）可实现DNA扩增子AB与CD的连接。
   4. 培养所选菌株 气单胞菌属<....

结果

图1：染色体区域的生物信息学检测与引物设计。 （A）在嗜水气单胞菌AH-1和鱼毒性气单胞菌AH-3中鉴定出的染色体区域示意图。嗜水气单胞菌AH-1的鞭毛糖基化岛代表仅含有拟唾液酸衍生物作为鞭毛糖的菌株，而鱼毒性气单胞菌AH-3的鞭毛糖基化岛则代表鞭毛糖为杂多糖的菌株。黑色标注的基因为参与拟唾液酸生物合成的基因.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 循环测序即用反应试剂盒	Applied Biosystems	4337455	用于测序
AccuPrime Taq DNA 聚合酶，高保真	Invitrogen	12346-086	用于扩增 AB、CD 和 AD 片段
琼脂糖	Conda-Pronadise	8008	用于 DNA 电泳
碱性磷酸酶，小牛肠（CIAP）	Promega	M1821	用于去除 5’ 端的磷酸基团
Bacto 琼脂	Becton Dickinson	214010	用于运动性分析
BamHI	Promega	R6021	用于内切核酸酶限制性酶切
BglII	Promega	R6081	用于内切核酸酶限制性酶切
BioDoc-It 成像系统	UVP		用于 DNA 可视化的生物成像系统
Biotaq 聚合酶	Bioline	BIO-21040	用于菌落筛选
Cytiva illustra GFX PCR DNA 及凝胶条带纯化试剂盒	Cytivia	28-9034-71	用于 PCR 扩增产物和 DNA 片段的纯化
EDTA	Applichem	131026.1211	用于 DNA 电泳
电穿孔比色皿，2 mm 间隙	VWR	732-1133	用于转化
LB（Luria-Bertani）Miller 琼脂	Condalab	996	用于 Escherichia coli 培养
LB（Luria-Bertani）Miller 肉汤	Condalab	1551	用于 Escherichia coli 培养
Nanodrop ND-1000	NanoDrop Technologies Inc		用于 DNA 定量的分光光度计
利福平	Applichem	A2220,0005	用于三亲交配
SOC 培养基	Invitrogen	15544034	用于电穿孔后的细胞恢复
T4 DNA 连接酶	Invitrogen	15224017	用于连接反应
Veriti 96 孔梯度 PCR 仪	Applied Biosystems		用于 PCR 反应