分离含有基因组转座子插入的革兰氏阴性菌

摘要

来源：Kazi, M. I., 等.，利用高通量测序技术构建革兰氏阴性菌转座子插入文库。 J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了基于卡那霉素抗性对含有转座子插入的革兰氏阴性受体菌进行筛选、定量和保存的方法。

方案

最终细菌突变文库的构建

1. 将一份冷冻的交配混合物在冰上解冻。
2. 根据步骤3.1计算的菌落形成单位（CFU），在添加卡那霉素的150 mm LB琼脂平板上进行涂布交配。涂布前用LB调整体积，使每13,333 µL产生150个菌落。
   注意： 此处的菌落形成单位（CFU）计数约为10⁵ CFU/mL，因此调整了杂交体积，以使每块平板获得13,333个菌落。这样可在30块平板上获得适量菌落，既保证高分辨率突变体文库的构建，又避免平板菌落过度拥挤。
3. 使用无菌玻璃珠将每块平板150 µL的稀释液涂布于添加卡那霉素的30 x 150 mm LB琼脂平板上，以获得400,000个菌落（图1C).
   注意： 可使用无菌涂布棒或任何其他无菌涂布工具（如玻璃珠）将细菌涂布于平板上。
4. 处理含有过量交配液的使用过的离心管。
   注意： 冻融循环会对细菌培养物施加选择性压力，从而可能影响Tn-seq实验结果。每次使用新鲜分装的样品。
5. 37 °C 培养 14 小时。
   注意： 孵育时间已优化，以防止过度生长（菌落相互接触）。建议通过缩短孵育时间来减少菌体生长。

估算文库浓度及混合以进行储存

1. 计数每块平板上的菌落形成单位（CFU），以估算转座子文库中的总突变体数量。至少选取3块平板，计数其中20%的菌落，以推算所有平板的菌落总数（图2A）。确保所计数的菌落彼此不接触。
2. 计算出预估的菌落产量后，向每块平板中加入3–5 mL LB培养基（如需要可更多），使用无菌刮菌工具刮下细菌。注意：本实验使用无菌接种环以高效刮取平板上的菌体。
3. 将所有平板的细菌悬液汇集至50 mL锥形管中（图1D）。此过程需使用多个50 mL锥形管，至少3个。
4. 将汇集的细菌悬液在5,000 x g 条件下离心7分钟，收集菌体沉淀。
5. 弃去上清液，将沉淀重悬于5 mL添加了30%甘油的LB培养基中。
6. 将转座子文库悬液以每管1 mL分装至冻存管中，并于-80 °C保存。

结果

图1：转座子突变文库构建示意图。 （A）细菌接合。编码转座机制的“供体”菌株与“受体”菌株混合，将混合物点种于Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，使其接合1小时。（B）转座子文库的构建。携带转座机制的质粒从“供体”菌株转移至“受体”菌株，转座子随机插入“受体”菌株的基因组中。（C）筛选。将接合后的细胞接种于添加卡那...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
150 mm × 15 mm 培养皿	Corning	351058
50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	Fisher Scientific	12-565-271
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	氨苄青霉素敏感，卡那霉素敏感
Escherichia coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP 营养缺陷型，生长需外源添加 600 mM DAP。含有 RP4 转移系统，用于质粒转移。JNW68（36）的载体
外螺纹冷冻管	Corning	09-761-71
玻璃珠	Corning	72684
甘油	Fisher Scientific	G33
接种环	Fisher Scientific	22-363-602	刮取工具
卡那霉素	Fisher Scientific	BP906	使用浓度为 25 mg/L
LB 琼脂，Miller 配方	Fisher Scientific	BP1425
LB 肉汤，Miller 配方	Fisher Scientific	BP1426
磷酸盐缓冲液，10X 溶液	Fisher Scientific	BP39920	稀释至 1X 使用