Staphylococcus aureus 中的感受态诱导 DNA 摄取

摘要

来源： Cafini, F., 等水平基因转移研究的方法学 金黄色葡萄球菌. J. Vis. Exp. (2017)

本视频通过自然转化展示了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在诱导条件下的DNA摄取能力。将一株经基因改造、可组成型表达σ因子且对氯霉素敏感的菌株在营养受限条件下培养以增强其感受态，随后与携带抗性基因的供体DNA共同孵育。通过筛选能在氯霉素中生长的转化子，确认基因转移成功。

方案

1. 自然转化

注意： 使用 N315 的衍生株 N2-2.1 作为受体菌。在此菌株中，sigH 位点被重复拷贝，从而实现 SigH 的组成型表达。如果待转移的抗性标记不是氯霉素，则可使用携带 pRIT-sigH（Cm^R）的质粒来表达 SigH。转化所用的供体 DNA 可使用从获得 cfr 基因的 S. aureus COL-45 中提取的纯化质粒或总 DNA。

1. 供体DNA的制备
   1. 在含有50 mL添加32 mg/L氯霉素的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的300 mL三角瓶中，于37 °C振荡培养COL-45过夜。同时培养携带pHY300质粒^(TetR)的E. coli HST04，用于提取质粒作为对照实验。
      注意：HST04 (dam^-/dcm^-) 缺乏DNA甲基化酶基因。其他常规含有DNA甲基化酶的菌株也可用于制备供体DNA，因为DNA甲基化状态不影响转化效率。此外，也可使用从S. aureus COL菌株中纯化的pT181质粒作为转化实验的阳性对照。
   2. 通过离心（4 °C，8,000 x g，10分钟）收集细胞。
   3. 使用质粒DNA提取试剂盒或常规DNA纯化方法提取并纯化质粒DNA。
   4. 使用分光光度计定量纯化后的DNA，并于4 °C保存备用。
      注意：转化实验应使用新鲜制备的DNA，通常不超过一周。陈旧的DNA样品会降低转化效率。
2. 转化实验
   1. 将受体菌株（N2-2.1）在5 mL TSB培养基中，于37 °C振荡培养过夜。
   2. 取0.5 mL过夜培养物转移至1.5 mL离心管中，离心沉淀细胞（4 °C，10,000 x g，1分钟）。
   3. 将细胞重悬于50 mL离心管中的10 mL CS2培养基中。
      注意：CS2培养基是一种完全合成培养基，可诱导S. aureus产生自然感受态。其他标准实验室培养基，如TSB或脑心浸液（BHI），不适合用于转化。
   4. 将细菌在37 °C振荡（180 rpm）培养至对数生长后期（约8小时）。
   5. 离心收集细胞（4 °C，5,000 x g，5分钟）。
   6. 将细胞重悬于10 mL新鲜CS2培养基中。
   7. 向细胞悬液中加入10 µg纯化的质粒或基因组DNA（步骤1.1.4）。在37 °C、180 rpm条件下振荡孵育2.5小时。
      注意：与DNA共孵育时间较短（<2.5小时）会导致转化频率降低。
   8. 离心收集细胞（4 °C，5,000 x g，5分钟）。
   9. 将细胞重悬于10 mL BHI培养基中，然后与90 mL已融化并预热至55 °C的BHI琼脂（含32 mg/L氯霉素，对照实验中使用5 mg/L四环素）混合均匀，倒入90 mm培养皿中。迅速冷却并使琼脂凝固。
   10. 将平板置于37 °C培养2天。
   11. 通过将菌落（使用牙签）转移至含相应抗生素的新BHI琼脂平板上，复制产生的转化子菌落，以确认其抗性特征。通过菌落PCR验证获得的抗性基因（cfr 或 tetM）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）	Becton Dickinson	211825
脑心浸液（BHI）	Becton Dickinson	211059
琼脂粉	Wako Pure Chemical Industries	010-08725
QIAfilter 质粒中量提取试剂盒	QIAGEN	12243