一种基于多孔板液体的筛选C. elegans基因敲低的实验方法

摘要

来源：Anderson, Q. L. 等 一种高通量、高内涵、基于液体的C. elegans病害系统。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种利用Caenorhabditis elegans进行高通量筛选的方法，用于研究宿主-病原体相互作用过程中基因敲降的影响。该方法概述了制备基因敲降线虫并将其转移至检测培养板的实验步骤，以评估病原体诱导的线虫死亡效应。

方案

1. 多重筛选的适应性改造 秀丽隐杆线虫 菌株或基因敲降（RNA干扰（RNAi）筛选实验设置）

注意： 这是一项针对 24 孔板设置的 RNAi 筛选实验。

1. 向含有接种了RNAi细菌的线虫的24孔板中每孔加入1 mL S Basal培养基。通过轻轻摇动培养板使线虫悬浮，随后将线虫转移至一个洁净无菌的24孔深孔板中。静置使线虫自然沉降（约5分钟）。
2. 吸除上清液，每孔保留约1 mL。向每孔中加入7 mL S Basal培养基。
3. 至少重复步骤1.1–1.2两次以上。最后一次洗涤后，吸除上清液，每孔保留约400 µL。
4. 利用线虫分选仪的Resampler功能，将24孔板中的线虫悬液每孔分选22条线虫至384孔板的各孔中（每孔24孔板样品可分配至384孔板的8–12个孔）。
   1. 为避免线虫饥饿，在分选前应先用移液器将细菌（可用仅作为食物的菌株如OP50，或致病性菌株）加入384孔板中。
5. 线虫分选至384孔板后，加入小分子化合物或其他实验所需的试剂。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		大型物体流式细胞仪/线虫分选仪
24孔深孔RB板	Thermo Fisher Scientific	CS15124
384孔板	Greiner Bio-One	MPG-781091
线虫生长培养基（NGM）			每升配制用量：18克琼脂，3克NaCl，2.5克蛋白胨，1 mL氯化钙（1 M），1 mL硫酸镁（1 M），25 mL磷酸盐缓冲液，973 mL milli-Q水
S基础培养基（S Basal）			每升配制用量：5.85克NaCl，6克磷酸二氢钾，1克磷酸氢二钾，1升milli-Q水
琼脂	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
蛋白胨	USBiological Life Sciences	P3300
氯化钙	USBiological Life Sciences
硫酸镁	Fisher Scientific	M63-500
磷酸盐缓冲液			每升配制用量：132 mL磷酸二氢钾（1 M）和868 mL磷酸氢二钾（1 M）
磷酸二氢钾	Acros Organics	7778-77-0
磷酸氢二钾	USBiological Life Sciences	P5100
细菌菌株
P. aeruginosa (PA14)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi表达菌株（HT115）
线虫菌株
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)