评估致病菌诱导的 C. elegans 幼虫死亡率

摘要

来源：Anderson, Q. L., 等。一种高通量、高内涵、基于液体的C. elegans病理系统。J. Vis. Exp. (2018)

该视频展示了一种基于液体的检测方法，其中将基因改造的C. elegans幼虫置于微孔板中暴露于致病性细菌。细菌分泌到培养基中的毒素会引发宿主应激反应并导致死亡。荧光染料对死亡的线虫进行染色，从而可通过成像手段对死亡率进行定量，以评估基因层面的易感性或抗性。

方案

1. 液体杀灭实验设置（基本方案）

注意：本实验方案适用于一种细菌菌株和一种来源的线虫。

1. 使用细胞刮刀从慢杀培养基（Slow Killing，SK）平板上刮取Pseudomonas aeruginosa，并重悬于约 5 mL S 基础培养基（S Basal）中。根据需要进行放大操作。使用分光光度计测定菌液的光密度（OD₆₀₀）。
2. 在 S 基础培养基中配制 24 mL P. aeruginosa 稀释菌液，调整至 OD₆₀₀ ≈ 0.09（为最终浓度的 3 倍）。参见步骤 4.6.2 以确定每孔最终成分，并相应调整菌液稀释体积。
3. 加入 21 mL 液体慢杀培养基（每升含 3 g NaCl、3.5 g 胰蛋白胨，并添加 CaCl₂ 和 MgSO₄ 至终浓度均为 1 mM）。使用多通道移液器，将 45 µL 菌液与培养基混合液加入 384 孔板的每一孔中。
4. 将线虫从原培养体系中冲洗至 50 mL 圆底离心管中，静置使线虫在重力作用下沉降。吸除上清液至剩余 5 mL。用共 50 mL 的 S 基础培养基重悬线虫。
5. 重复步骤 1.4 两次。
6. 使用线虫分选仪，将约 22 条线虫分选至 384 孔板的每一孔中。
   注意： 分选过程每条线虫携带约 1.1 µL 液体。22 条线虫共引入 25 µL 液体，使每孔总反应体积达到 70 µL。
   1. 每孔最终体积为 70 µL，其中 45 µL 为细菌培养基（包含 0.03 OD₆₀₀ 的细菌、24 µL S 基础培养基，以及 21 µL 添加了 CaCl₂ 和 MgSO₄ 的 SK 培养基）。其余 25 µL 由 22 条线虫带入。
   2. 若无法使用此处所述的分选仪（见材料表），可将线虫用 S 基础培养基稀释至终浓度为 1 条线虫/µL，并使用多通道移液器每孔加入 25 µL。但此方法可能导致实验结果变异性增加。此外，也可采用 Leung 及其同事所述的蠕动泵液体分配器进行操作。
7. 在线虫分选至 384 孔板后，用透气封膜密封板子，并在 25 °C 下孵育 24–48 小时。
8. 在预定时间点，使用微孔板洗板机用 S 基础培养基对 384 孔板进行总共 5 次洗涤。
   1. 第二次洗涤后，吸除大部分培养基，保留约 20 µL。使用微孔板涡旋振荡器剧烈振荡至少 30 秒，以使孔底残留物充分松动。
9. 最后一次洗涤后，将上清液吸除至剩余 20 µL。向 384 孔板每孔加入 50 µL 0.98 µM 的核酸染料（见材料表），使终浓度为 0.7 µM。
10. 室温孵育 12–16 小时。该染料仅对死亡线虫染色。在所需孵育时间结束后，使用微孔板洗板机清洗孔板以去除过量染料（至少清洗 3 次）。
11. 进行数据采集时，使用分光光度计或自动显微镜对透射光和荧光图像（激发波长 531 nm，发射波长 593 nm）进行成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		大型物体流式细胞仪/线虫分选仪
Cytation 5	BioTek
EL406 洗板与分配系统	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24孔深孔RB板	Thermo Fisher Scientific	CS15124
384孔板	Greiner Bio-One	MPG-781091
线虫生长培养基（NGM）			每升用量：18 克琼脂，3 克 NaCl，2.5 克蛋白胨，1 mL CaCl₂ (1 M)，1 mL MgSO₄ (1 M)，25 mL 磷酸盐缓冲液，以及 973 mL 去离子水
慢杀培养板（SK板）			每升用量：18 克琼脂，3 克 NaCl，3.5 克蛋白胨，1 mL CaCl₂ (1 M)，1 mL MgSO₄ (1 M)，25 mL 磷酸盐缓冲液，以及 973 mL 去离子水
慢杀培养基（SK培养基）			每升用量：3 克 NaCl，3.5 克蛋白胨，1 mL CaCl₂ (1 M)，1 mL MgSO₄ (1 M)，25 mL 磷酸盐缓冲液，以及 973 mL 去离子水
胰蛋白胨肉汤（LB）	USBiological Life Sciences	L1520
脑心浸出液肉汤（BHI）	Research Products International Corp	50-488-526
线虫漂白液			每100 mL用量：10 mL 5 M NaOH溶液，20 mL 5%次氯酸钠溶液，以及70 mL无菌水
S基础培养基（S Basal）			每升用量：5.85 克 NaCl，6 克 KH₂PO₄，1 克 K₂HPO₄，以及1升去离子水
琼脂	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
蛋白胨	USBiological Life Sciences	P3300
CaCl₂	USBiological Life Sciences
MgSO₄	Fisher Scientific	M63-500
磷酸盐缓冲液			每升用量：132 mL K₂HPO₄ (1 M) 和 868 mL KH₂PO₄ (1 M)
KH₂PO₄	Acros Organics	7778-77-0
K₂HPO₄	USBiological Life Sciences	P5100
5%次氯酸钠溶液	BICCA	7495.5-32
NaOH溶液	Fisher Scientific	SS255-1
Breathe-easy	Diversified Biotech	BEM-1
SYTOX Orange 核酸染料	Fisher Scientific	S11368
细菌菌株
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis (OG1RF)
E. coli 超级食物菌株 (OP50)
E. coli RNAi表达菌株 (HT115)
线虫菌株
glp-4(bn2) (Beanan 和 Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP 报告基因菌株 (Kang 等, 2018, PMID: 29532717)