评估 秀丽隐杆线虫 幼虫病原菌诱导的死亡率

摘要

资料来源： Anderson， Q. L. 等人。一种高通量、高含量、液体基 秀丽隐杆线虫 病理学系统。 J. Vis. Exp. （2018年）

该视频演示了一种基于液体的测定，其中转基因秀 丽隐杆线虫 幼虫暴露于微孔板中的病原菌。分泌到培养基中的细菌毒素会诱导宿主压力和死亡。荧光染料对死虫进行染色，允许基于成像的死亡率量化，以评估遗传易感性或耐药性。

方案

1. 液体杀灭测定设置（基本方案）

注意： 这是针对一种细菌菌株和一种蠕虫来源的方案。

1. 使用细胞刮刀，从慢杀或SK板中取出 铜绿假单胞菌 ，并重悬于~5mL的S基础中。如果需要，可以扩大规模。使用分光光度计（OD₆₀₀）测量细菌悬浮液的光密度
2. 在OD₆₀₀ ≈ 0.09（3倍终浓度）的S Basal中制备24mL稀释的铜绿假单胞菌原液。每孔的最终含量见 4.6.2，并相应地缩放细菌稀释液的体积。
3. 加入 21 mL 液体慢杀培养基（3 g NaCl，3.5 g 蛋白胨/L，补充有 CaCl₂ 和 MgSO₄ ，终浓度为 1 mM）。使用多通道移液器，将 45 μL 细菌和培养基转移到 384 孔板的每个孔中。
4. 将蠕虫从源头清洗到50mL锥形管中，让蠕虫在重力下沉降。吸出上清液至5mL。重悬于总共 50 mL S 基础中。
5. 重复步骤 1.4 两次。
6. 使用蠕虫分选机，将大约 22 条蠕虫分选到 384 孔板的每个孔中。
   注意： 该装置将每个蠕虫滴入~1.1μL液体中。22 条蠕虫将达到 25 μL，使总测定体积达到 70 μL/孔。
   1. 每个孔的最终成分由 70 μL 组成。将 45 μL 该体积作为细菌培养基添加（0.03 OD₆₀₀ 细菌在 24 μL S 基础中，以及 21 μL SK 补充有 CaCl₂ 和 MgSO₄）。另外 25 μL 与 22 个蠕虫一起加入。
   2. 如果此处使用的分选机（参见 材料表）不可用，则可以在S Baseal中将蠕虫稀释至终浓度为1 worm / μL，并使用多通道移液器移液25μL /孔。然而，结果可能会表现出更大的变异性。或者，可以使用蠕动液体分配器，如 Leung 及其同事所描述的那样。
7. 将蠕虫分选到384孔板中后，用透气膜密封板，并将板在25°C下孵育24-48小时。
8. 在所需时间，使用微孔板清洗机用 S Basal 洗涤 384 孔板共 5 次。
   1. 第二次洗涤后，吸出大部分培养基，留下~20μL。使用微孔板涡旋器剧烈摇动板至少30秒，以松开孔底部的任何碎屑）。
9. 最终洗涤后，将上清液吸至20μL。加入50μL的0.98μM核酸染色剂（参见 材料表）/384孔板的孔，最终浓度为0.7μM。
10. 在室温下孵育12-16小时。这种染料只会弄脏死虫。在所需的孵育期后，使用微孔板清洗机清洗板以去除任何多余的污渍（至少洗涤 3 次）。
11. 对于数据采集，使用分光光度计或自动显微镜对透射光和荧光（531 nm激发和593 nm发射）进行成像。

材料