RNAi 表达细菌的培养与维护

摘要

来源：Anderson, Q. L., et al., 一种高通量、高内涵、基于液体的C. elegans病理系统。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了携带质粒以抑制靶基因表达的RNA干扰（RNAi）细菌的制备过程。介绍了RNAi细菌的筛选、培养和诱导步骤，以制备用于下游实验的表达双链RNA（dsRNA）的平板。

方案

1. RNA干扰（RNAi）细菌的制备

1. 从冻存菌种中将含有RNAi的细菌菌株划线或点种转移到含有适当抗生素的LB（Luria-Bertani）琼脂平板上（Ahringer和Vidal文库使用含羧苄青霉素100 µg/mL和四环素15 µg/mL的平板）。
   注意：操作非致病性细菌时，应使用生物安全等级（BSL）-2 A/B级生物安全柜或BSL-1层流罩，以确保培养物无菌，并最大限度减少文库交叉污染的风险。
2. 在37 °C下培养平板24小时。
3. 将平板在4 °C下保存，最多可保存两周。
   1. 两周后，丢弃平板，并更换为新制备的平板。
4. 通过将每个克隆的单个菌落分别接种至24孔深孔板的单孔或无菌试管中，加入4 mL含羧苄青霉素的LB液体培养基，以平行测试多个RNAi菌株。
   注意：已有报道指出四环素会降低RNAi效率，因此本步骤所用培养基中不应添加四环素。
5. 将24孔深孔板放入适用于多孔板的摇床培养箱中，在37 °C、950 rpm条件下振荡培养16小时。 注意： 使用常规摇床培养箱时，难以在多孔板中获得均匀的细菌生长。摇床必须能够以至少750 rpm的速度振荡，才能保证培养物正常生长。若无专用摇床，可将每种培养物分别在单独的试管中培养，之后再转移至24孔板进行离心。
6. 以2,000 × g离心5分钟收集细菌。
7. 通过倒置平板并剧烈震荡的方式弃去上清液。将RNAi细菌重悬于100 µL S基础培养基中（5.85 g氯化钠，NaCl；1 g磷酸氢二钾，K₂HPO₄；6 g磷酸二氢钾，KH₂PO₄，溶于1 L超纯水中，经高压灭菌处理）。
8. 用移液器将重悬的细菌加入适量孔数的多孔NGM平板中（线虫生长培养基，Nematode Growth Media，每升含3 g NaCl、2.5 g蛋白胨、1 mM氯化钙，CaCl₂；1 mM硫酸镁，MgSO₄；25 mL磷酸盐缓冲液（每升用量：132 mL 1 M K₂HPO₄ 和 868 mL 1 M KH₂PO₄），以及18 g琼脂），并补充IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，终浓度1 mM）和羧苄青霉素（终浓度100 μg/mL）。
   1. 6孔板每孔使用3.5 mL NGM培养基，24孔板每孔1 mL，96孔板每孔150 µL。
   2. 6孔板每孔加入100 μL细菌悬液，24孔板每孔50 μL，96孔板每孔20 μL。静置晾干。
      注意：通常在无菌通风橱中进行干燥，以促进快速且均匀的干燥过程。均匀干燥至关重要。避免过度干燥，因琼脂开裂会导致线虫钻入，从而造成线虫丢失，并可能堵塞液体处理系统。
9. 制备好的平板应立即使用，或在4 °C下保存最多两周以备后续使用。
   注意：为防止平板干燥，可用塑料封口膜密封，或将其置于密闭容器中并放置湿润的纸巾。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24 孔深孔 RB 板	Thermo Fisher Scientific	CS15124
线虫生长培养基（NGM）			每升用量：18 克琼脂、3 克氯化钠、2.5 克蛋白胨、1 mL 氯化钙（1 M）、1 mL 硫酸镁（1 M）、25 mL 磷酸盐缓冲液，以及 973 mL 超纯水
LB 培养基（Lysogeny Broth）	USBiological Life Sciences	L1520
S 基础培养基（S Basal）			每升用量：5.85 克氯化钠、6 克磷酸二氢钾、1 克磷酸氢二钾，以及 1 升超纯水
琼脂	USBiological Life Sciences	A0930
氯化钠	USBiological Life Sciences	S5000
蛋白胨	USBiological Life Sciences	P3300
氯化钙	USBiological Life Sciences
硫酸镁	Fisher Scientific	M63-500
磷酸盐缓冲液			每升用量：132 mL 磷酸氢二钾（1 M）和 868 mL 磷酸二氢钾（1 M）
磷酸二氢钾	Acros Organics	7778-77-0
磷酸氢二钾	USBiological Life Sciences	P5100