使用微流控腔室对细菌在胁迫条件下的生长进行显微分析

摘要

来源：Cayron, J., 等．应激处理下细菌生长的多尺度分析．J. Vis. Exp. (2019)．

本视频演示了如何制备和使用微流控芯片，在胁迫条件下对细菌细胞进行成像。视频概述了引入细菌培养物和诱导胁迫的抗生素培养基的步骤，随后进行细胞加载和显微镜设置。通过相差模式的时间序列成像，观察因细胞分裂受抑制而导致DNA含量增加的细长丝状细胞的形成过程。

方案

1. 微流控延时显微成像
   1. 根据微流控软件用户指南中的说明，从微流控板中移除保存液，并替换为预热至 37 °C 的新鲜培养基。
   2. 将微流控板密封连接至流体控制装置，并点击“Priming”（灌注）按钮。
   3. 将带有流体控制装置的微流控板放置于显微镜载物台上，并在开始显微成像前于 37 °C 预热约 2 小时。
      注意：此预热步骤至关重要，可避免微流控腔室膨胀，否则会在延时实验过程中导致显微镜失焦，影响图像采集质量。
   4. 密封微流控板。将第 8 孔中的培养基替换为 150 µL 的培养样品，并根据需要将第 1 至第 5 孔中的培养基替换为含或不含诱导应激试剂的培养基。
   5. 密封微流控板并将其放置于显微镜载物台上。
   6. 在微流控软件中运行细胞加载程序。通过透射光显微镜观察，检查细胞加载是否充分。若腔室内细胞密度不足，可再次运行细胞加载程序。
   7. 在透射光模式下仔细调焦，并选择若干含有孤立细菌的视野。应选择不过于密集的区域，以便能够随时间监测单个细胞的生长（建议每 100 µm² 区域内有 ~10–20 个细胞）。这也有助于在图像分析过程中实现细胞的准确识别。
   8. 在微流控软件中，点击“Create a Protocol”（创建程序）按钮。可选地，编程注入生长培养基，持续时间为 1–2 个世代时间，以使细胞适应环境。随后，编程注入诱导应激的培养基，压力为 2 psi，持续 10 分钟，接着在 1 psi 压力下持续注入所需时长的应激处理培养基。若需分析细胞在应激后的恢复情况，可编程注入新鲜生长培养基，持续所需时间。
      注意：在本实验中，头孢氨苄以 2 psi 压力注入 10 分钟，随后在 1 psi 压力下持续注入 50 分钟；之后以 2 psi 压力注入新鲜生长培养基 10 分钟，再在 1 psi 压力下持续 3 小时。
   9. 以延时模式进行显微成像，每隔 10 分钟采集一帧图像，使用透射光相位差模式，并根据需要使用 560 nm 激发光源检测 mCherry 信号。
      注意：显微图像采集的开始时间必须与微流控注入程序的启动时间同步。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CellASIC ONIX 微流控系统	Merck Millipore	CAX2-S0000	微流控系统
CellASIC ONIX2 FG	Merck Millipore	ONIX2 1.0.1	微流控软件
CellASIC ONIX2 配流基板基础组件	Merck Millipore	CAX2-MBC20	配流系统
携带染色体插入 hupA-mCherry 融合基因的大肠杆菌菌株			通过 P1 转导将 hupA-mCherry 插入大肠杆菌 MG1655 染色体构建而成
CellASIC ONIX 微流控芯片板	Merck Millipore	B04A-03-5PK	微流控系统的芯片板
尼康 Eclipse Ti 显微镜	Nikon		荧光显微镜
MOPS EZ 富集定义培养基（RDM）	Teknova	M2105	富集生长培养基，含 10× MOPS 混合液、0.132 M K₂HPO₄、10× AGCU、5× EZ 补充剂、20% 葡萄糖，经 0.22 μm 滤膜过滤