使用梯度抑制平板评估细菌群集运动

摘要

来源：Guo, S., et al. 在诱导剂梯度平板上定量细菌表面群集运动能力。 J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了利用双层梯度群游平板研究在不同抑制剂浓度下细菌群游行为的方法。在底层含有形成浓度梯度的抑制剂的平板上接种细菌并进行培养。通过定期采集图像，分析抑制剂浓度对细菌群游的影响。

方案

1. 梯度群集平板的制备

1. 群游培养基的制备
   注意：本实验方案中使用了0.7%（w/v）琼脂浓度的群游培养基。
   1. 在两个锥形瓶中分别配制含琼脂的LB（Lysogeny broth）粉末；每个锥形瓶中含有2 g胰蛋白胨、2 g氯化钠（NaCl）、1 g酵母提取物和1.4 g琼脂。加入双蒸水（ddH₂O），并使用磁力搅拌子搅拌悬浮液。通过添加额外的ddH₂O将最终体积调至200 mL。
   2. 在121 °C条件下高压灭菌20分钟。使用透气瓶盖或带通气孔的封口膜进行密封。
      注意：琼脂在高压灭菌过程中加热后会溶解。
   3. 当温度降至65 °C时，混匀溶液以确保均匀性，并将培养基转移至65 °C的培养箱或水浴中，用于短期使用。
2. 底层群游培养基的制备
   注意：底层培养基是群游培养基与诱导剂储备液的混合物。诱导剂梯度群游平板的配方见表1。
   1. 将114.12 mg冻干白藜芦醇粉末溶于5 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配制成100 mM白藜芦醇储备液，并将溶液储存在-20 °C。
   2. 将6 g阿拉伯糖粉末溶于30 mL ddH₂O中，配制成20%（w/v）阿拉伯糖储备液；静置10–15分钟以确保完全溶解；溶液可在室温下保存。
   3. 从65 °C培养箱中取出培养基并置于室温环境中；让群游培养基冷却至锥形瓶表面可安全手持（约50 °C）。不要将群游培养基长时间放置于室温，以免琼脂提前凝固。
   4. 在50 °C时向群游培养基中加入所需体积的诱导剂储备液（表1）。使用移液器加入诱导剂溶液，避免倾倒。轻轻旋转混匀，使诱导剂与群游培养基充分混合。
      注意：此步骤适用于不能高压灭菌的诱导剂。操作时需注意避免在培养基中引入气泡。
3. 双层梯度群游平板的制备
   注意：上层培养基为含0.7%（w/v）琼脂的LB培养基。
   1. 用诱导剂名称和菌株标记13 × 13 cm的方形培养皿，并将培养皿倾斜支撑在皿盖边缘（图1B）。
   2. 使用50 mL移液管或50 mL离心管加入40 mL温热的底层培养基（50 °C）。
      注意：对于13 × 13 cm的方形培养皿，40 mL的底层和上层培养基量合适；对于10 × 10 cm的方形培养皿，则适合使用25 mL的底层和上层培养基。
   3. 将未加盖的方形培养皿置于超净工作台中，使底层培养基固化1小时。在培养基凝固过程中请勿扰动培养皿。
      注意：在底层固化期间，不含诱导剂的群游培养基应保持在65 °C的培养箱或水浴中。
   4. 待底层完全凝固后，移去皿盖并将方形培养皿放入超净工作台中。
   5. 使用50 mL移液管或50 mL离心管加入40 mL温热的上层培养基（50 °C）。
      注意：上层培养基不含诱导剂。
   6. 将双层平板在实验台面上静置固化，加盖且勿扰动，持续1小时。制备好的平板可在4 °C保存最多24小时。​注意：过长的固化时间会降低水分含量，从而限制群游运动能力。

2. 生长 E. coli K12 和 P. aeruginosa PAO1

1. 将 5 g 胰蛋白胨、5 g NaCl 和 2.5 g 酵母提取物加入去离子水（ddH₂O）中，配制 500 mL LB 培养基，并加水定容至 500 mL。在 121 °C 条件下，使用液体循环程序高压灭菌 20 分钟，然后于 4 °C 保存。
2. 将 1 g 胰蛋白胨、1 g NaCl、0.5 g 酵母提取物和 1.5 g 琼脂加入去离子水（ddH₂O）中，配制 100 mL 1.5%（w/v）LB-琼脂培养基，并加水定容至 100 mL。在 121 °C 条件下，使用液体循环程序高压灭菌 20 分钟。将培养基转移至 50 °C 水浴中，以防止琼脂凝固。
3. 当 LB-琼脂培养基瓶可舒适持握时，使用 25 mL 移液管向一个直径为 10 cm 的培养皿中加入 20 mL LB-琼脂培养基。将平板在室温下放置过夜，并于 4 °C 保存。
4. 取保存于 -80 °C 的菌种，使用一次性接种环将 E. coli K12、E. coli K12-YdeH、P. aeruginosa PAO1 和 P. aeruginosa PAO1-YdeH 菌株划线接种至 LB-琼脂培养皿上。将培养皿倒置，在 37 °C 恒温培养箱中培养过夜。
5. 从培养皿中挑取不同菌株的单菌落，将每个菌落接种至 5 mL LB 培养基中，并在 37 °C、220 rpm 的恒温振荡摇床中培养。
6. 当菌液密度达到 OD600nm ~1.0 时，从摇床中取出菌液并置于室温下。按照步骤 3.2.1 所述方法，将菌液密度调整至 OD600nm = 1.0。

3. 梯度群集平板的接种与培养

1. 接种孔的制备
   注意：可使用能够生成标准间距孔的3D打印盖模型，替代下述方法。
   1. 在A4纸上标记孔的位置，如图1C所示。在一个方形培养皿中设置三个测试浓度，每个浓度设两到三个重复。
   2. 将标记好的A4纸置于已凝固的梯度平板下方。在标记位置处，将100 µL移液枪头较宽的一端插入半固体培养基表面，直至枪头接触上层培养基底部。
   3. 当枪头接触底部时，不再施加垂直方向的力；轻轻旋转枪头，以分离出圆柱形孔中的培养基。
   4. 将移液枪头沿水平方向轻微移动极短距离，使空气进入预留的狭窄空间。用食指按压枪头以阻断枪头内部气体流动，同时用拇指和中指夹持移液器。
   5. 垂直向上拔出枪头，拔出过程中保持孔内培养基留在枪头中。
      注意：若孔内培养基滑脱，可稍增加食指压力，确保枪头完全密封。
   6. 在每个标记位置重复步骤3.1.2至3.1.5。接种前盖好趋化运动平板的盖子。
2. 梯度平板接种与培养
   1. 将过夜培养的菌液调整至OD600nm = 1.0。
   2. 将80 µL过夜培养菌液加入每个孔中。注意避免菌液溢出至孔外。
   3. 用密封膜包裹培养皿。若需长期观察（3–5天），则使用无菌实验室橡胶胶带包裹培养皿。
      注意：橡胶胶带不易断裂。
   4. 在培养箱内放置盛有ddH₂O的烧杯，以维持培养箱内湿度。将梯度趋化平板置于37 °C培养。
      注意：切勿将趋化平板倒置培养，否则会导致菌液从孔中泄漏。
   5. 接种后立即拍摄趋化平板图像，并记为0 h时间点。

4. 细菌表面群集运动的成像

1. 每12小时从培养箱中依次取出 swarm 平板，每次取一个，保持平板水平，放入凝胶成像系统（见材料表）。
   注意：切勿在平板表面留下指纹；应戴洁净手套握住 swarm 平板的侧面。
2. 选择凝胶成像模式；用白光照射 swarm 平板；调节焦距以获得 swarm 最清晰的图像。
   注意：同一批次的所有平板应使用相同的焦距。
3. 通过将曝光时间调整为300 ms来增强 swarm 的亮度，以便清晰观察；调节阈值以最小化背景光的干扰。
   注意：阈值需在凝胶成像系统的操作界面上进行调整。增加左侧数值可减少背景光干扰；降低右侧数值可增强 swarm 的亮度。本实验方案中，该区域数值通常介于6,000至50,000之间。
4. 保存图像文件以供后续分析。将成像时间、诱导剂类型、梯度方向和菌株信息记录在.txt文件中。

表1：双层群体迁移培养基配方。

上层培养基/溶菌肉汤培养基（每 100 mL）
胰蛋白胨：1 g
氯化钠：1 g
酵母提取物：0.5 g
琼脂：0.7 g
下层培养基/含诱导剂培养基（每 100 mL）
胰蛋白胨：1 g	工作浓度：	储备液浓度：
氯化钠：1 g
酵母提取物：0.5 g	- 白藜芦醇：400 μM	- 白藜芦醇：100 mM
琼脂：0.7 g
诱导剂：	- 阿拉伯糖：0.5% (w/v)	- 阿拉伯糖：20% (w/v)
- 白藜芦醇储备液：400 μL	或 1% (w/v)
- 阿拉伯糖储备液：2.5 mL 或 5 mL

结果

图1：诱导剂梯度群游平板的制备、接种与培养示意图。 （A）细菌培养物在37 °C条件下过夜培养。（B）双层诱导剂梯度群游平板的操作流程。i）将方形培养皿垫高。ii）倒入底层培养基，并在室温下凝固。iii）将方形培养皿放平，倒入上层培养基。iv）平板固化。v）在标记位置打孔。vi）将细菌培养物加入孔中。vii）用封口膜或橡胶带密封...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich	V900500	500 g
氨苄青霉素	Solarbio	A8180	25 g, ≥ 85% (GC)
离心管	Corning	430790	15 mL
冻存管	Corning	430488	2 mL
二甲基亚砜（DMSO）	Aladdin	D103272	AR, > 99% (GC)
L(+)-阿拉伯糖	Aladdin	A106195	98% (GC), 500 g
培养皿	Bkman	B-SLPYM90-15	塑料培养皿，圆形，90 mm × 15 mm
白藜芦醇	Aladdin	R107315	99% (GC), 25 g
氯化钠	Macklin	S805275	AR, 99.5% (GC), 500 g
方形培养皿	Bkman	B-SLPYM130F	塑料培养皿，方形，13 mm × 13 mm
胰蛋白胨	Thermo Scientific Oxoid	LP0042	500 g
酵母提取物	Thermo Scientific Oxoid	LP0021	500 g
仪器设备
生化培养箱	Blue pard	LRH-70
Tanon 5200multi 成像系统	Tanon	5200CE
恒温水浴锅	Jinghong	DK-S28