使用梯度抑制板评估细菌群

摘要

资料来源： Guo， S. 等人。量化诱导梯度板上的细菌表面蜂群运动。 J. Vis. Exp.（2022）。

该视频演示了使用双层梯度蜂群板来研究不同抑制剂浓度下的细菌蜂群行为。在底层带有梯度形成抑制剂的板中接种细菌并孵育。定期捕获图像以分析抑制剂浓度对细菌群化的影响。

方案

1. 梯度蜂群板的制备

1. 蜂群培养基的制备
   注意：本方案中使用了0.7%（w / v）琼脂浓度的群体培养基。
   1. 在两个锥形烧瓶中用琼脂制备溶原性肉汤（LB）粉末;每个烧瓶含有 2 克胰蛋白胨、2 克氯化钠 （NaCl）、1 克酵母提取物和 1.4 克琼脂。加入双蒸水（ddH₂O）并使用磁力搅拌棒搅拌悬浮液。通过添加额外的ddH₂O将最终体积调整为200mL。
   2. 将溶液在121°C下高压灭菌20分钟。使用带通风口的透气瓶盖或瓶子密封膜。
      注意：琼脂在高压灭菌器中加热时会溶解。
   3. 当温度降至65°C时，混合溶液以确保均匀性，并将培养基转移到65°C培养箱或水浴中短期使用。
2. 底层蜂群培养基的制备
   注意：底层培养基是蜂群培养基和诱导剂储备溶液的混合物。诱导梯度群板的配方如 表1所示。
   1. 通过将114.12mg冻干白藜芦醇粉末溶解到5mL二甲基亚砜（DMSO）中，制备100mM白藜芦醇储备溶液，并将溶液储存在-20°C。
   2. 通过将 6 g 阿拉伯糖粉末溶解在 30 mL ddH₂O 中，制备 20% （w/v） 阿拉伯糖储备溶液;等待10-15分钟，让阿拉伯糖溶解;并将溶液在室温下储存。
   3. 从65°C培养箱中取出培养基，置于室温下;让蜂群培养基冷却，直到锥形瓶冷却到足以容纳 （~50 °C）。不要将蜂群培养基长时间放置在室温下，因为这会导致琼脂凝固。
   4. 在50°C下将所需体积的诱导剂储备溶液添加到蜂群培养基中（表1）。使用移液器分配诱导剂溶液而不是倾倒。轻轻旋转以将诱导剂与蜂群培养基混合。
      注意：此步骤适用于无法高压灭菌的诱导剂。小心不要将气泡引入介质中。
3. 双层梯度蜂群板的制备
   注意：上层培养基是含有0.7%（w / v）琼脂的LB培养基。
   1. 在 13 x 13 厘米方形培养皿上贴上诱导剂名称和菌株标签，并将培养皿支撑在盖子边缘（图 1B）。
   2. 使用 50 mL 移液器或 50 mL 离心管加入 40 mL 温底层培养基 （50 °C）。
      注意：或者，对于 13 x 13 cm 方形培养皿，40 mL 底层和上层培养基是合适的;对于 10 x 10 cm 方形培养皿，25 mL 底层和上层培养基是合适的。
   3. 让底层培养基在层流罩内裸露固化1小时。当培养基凝固时，不要打扰方形培养皿。
      注意：在固化底层时，不含诱导剂的蜂群培养基应保持在65°C培养箱或水浴中。
   4. 底层完全凝固后，取下盖子，将方形培养皿放入层流罩内。
   5. 使用 50 mL 移液器或 50 mL 离心管加入 40 mL 温热的上层培养基 （50 °C）。
      注意：上层培养基不含诱导剂。
   6. 固化台面上的双层板，盖上盖子，不受干扰1小时。将准备好的板在 4 °C 下储存长达 24 小时。注意：较长的固化时间会降低水分含量并限制蜂群运动。

2. 大肠杆菌 K12 和铜绿假单胞菌 PAO1 的生长

1. 将 5 g 胰蛋白胨、5 g NaCl 和 2.5 g 酵母提取物加入 ddH₂O 中，制备 500 mL LB 培养基，并将溶液加满至 500 mL。将溶液在121°C下在液体循环中高压灭菌20分钟，并将其储存在4°C。
2. 通过将 1 g 胰蛋白胨、1 g NaCl、0.5 g 酵母提取物和 1.5 g 琼脂加入 ddH₂O 中，制备 100 mL 的 1.5% （w/v） LB-琼脂培养基，并将溶液加满至 100 mL。在121°C下以液体循环高压灭菌溶液20分钟。将培养基转移到50°C水浴中以防止琼脂凝固。
3. 当 LB-琼脂培养基烧瓶握起来舒适时，使用 25 mL 移液器将 20 mL LB-琼脂培养基加入培养皿（直径 10 cm）中。将板在室温下放置过夜，并将LB-琼脂板储存在4°C。
4. 使用一次性接种环在 LB-琼脂培养皿上取储存在 -80 °C 下的储备培养物，条纹大 肠杆菌 K12、 大肠 杆菌 K12-YdeH、 铜绿假单胞 菌 PAO1 和 铜绿假单胞菌 PAO1-YdeH 菌株。将培养皿倒置在37°C下孵育过夜。
5. 从培养皿中挑选不同菌株的单个菌落，将每个菌落接种到 5 mL LB 培养基中，并将培养物在 37 °C 下孵育，在设置为 220 rpm 的实验室轨道振荡器中。
6. 当培养密度达到OD600nm~1.0时，将培养物从摇床中取出，置于室温下。将培养密度调整为OD600nm = 1.0，如步骤3.2.1中所述。

3. 梯度群板的接种和孵育

1. 接种井的制备
   注意：可以使用能够生成相隔标准距离的井的 3D 打印盖板模型来代替下述方法。
   1. 在A4纸上标记孔位，如 图1C所示。在一个方形培养皿中设置三个测试浓度，重复两次或三个。
   2. 将标记的 A4 纸放在固化的渐度板下。将 100 μL 移液器吸头的较宽侧推入标记位置的半固体培养基表面。按压移液器吸头，直到到达上层培养基的底部。
   3. 当尖端接触底部时，不要对尖端施加垂直力;轻轻旋转尖端以隔离圆柱形孔的内容物。
   4. 沿非常小的距离水平移动移液器吸头，以允许气流进入预留的狭窄空间。用食指按压吸头以阻止吸头内的气流，同时用拇指和中指握住移液器。
   5. 将吸头垂直拉出，在拉出时将井内容物保持在吸头中。
      注意：如果孔内容物滑动，请用食指稍微施加更大的压力以完全密封尖端。
   6. 在每个标记位置重复步骤 3.1.2 至 3.1.5。接种前盖住蜂群板。
2. 梯度板接种和孵育
   1. 将过夜生长培养密度调整为OD600nm = 1.0。
   2. 将 80 μL 过夜生长培养物移液到每个孔中。不要将细菌培养物洒在井外。
   3. 用密封膜包裹板。对于长期观察（3-5天），用无菌实验室橡胶胶带包裹板。
      注意：橡胶胶带不太可能断裂。
   4. 将装满ddH₂O的烧杯放入培养箱中，以保持培养箱内的湿度。将梯度群板在 37 °C 下孵育。
      注意：不要将蜂群板倒置孵育;这将导致细菌培养物从孔中泄漏。
   5. 接种后立即对蜂群板进行成像，将其记录为 0 小时时间点。

4. 成像细菌表面蜂群

1. 每12小时从培养箱中取出一个蜂群板，水平握住板，并将它们放入凝胶成像系统中（参见 材料表）。
   注意：不要在印版表面留下指纹;用干净的手套握住蜂群板的侧面。
2. 选择 凝胶成像 模式;将蜂群板暴露在白光下;并调整焦距以提供最清晰的蜂群视图。
   注意：对给定批次中的所有板使用相同的焦距。
3. 通过将 曝光时间 调整为 300 毫秒，增强蜂群的亮度以获得清晰的观察。调整 阈值 以尽量减少背景光的干扰。
   注意：阈值在凝胶成像系统的作界面上进行调整。增加左侧的值以尽量减少背景光的干扰;减小右侧的值以增强蜂群的亮度。在此协议中，区域通常在 6,000 到 50,000 之间。
4. 保存图像文件以供进一步分析。在 .txt 文件中记录成像时间、诱导剂类型、梯度方向和应变。

 

表1：双层蜂群培养基规格。

上层培养基/溶原性肉汤培养基（每 100 mL）
胰蛋白胨：1克
氯化钠：1克
酵母提取物：0.5克
琼脂：0.7克
底层培养基/含诱导剂培养基（每 100 mL）
胰蛋白胨：1克	工作浓度：	储备液浓度：
氯化钠：1克
酵母提取物：0.5克	- 白藜芦醇：400 μM	- 白藜芦醇：100 mM
琼脂：0.7克
诱导：	- 阿拉伯糖：0.5%（w/v）	- 阿拉伯糖：20%（w/v）
- 白藜芦醇储备液：400 μL	或 1% （w/v）
- 阿拉伯糖储备液：2.5 mL 或 5 mL

结果

图1：诱导剂梯度群板制备，接种和孵育示意图。 （A）细菌培养物在37 °C下过夜生长。（B）双层诱导梯度群板的工作流程。i） 支撑方形培养皿。ii） 倒入底层培养基并在室温下固化。iii） 将方形培养皿平放，倒入上层培养基。iv） 板材固化。v） 制作与标记位置相对应的井。vi） 将细菌培养物移液到孔中。vii） 使用密封膜或橡胶胶带包裹板。viii）将蜂群板置于37°C培养箱中。C） 在 A4 纸或 3D 打印模型上绘制井图。三孔，I）三个重复和II）两个重复

材料