细菌芽孢萌发过程中皮层降解的比色法检测

摘要

来源：Francis, M. B.，等．细菌芽孢萌发过程中皮层碎片的检测．J. Vis. Exp. （2016）．

本视频展示了一种比色法，通过随时间测定还原糖的释放来检测细菌芽孢萌发过程中皮层的降解。利用 N-乙酰葡萄糖胺标准品和不同时间点的样品，该检测方法通过紫色显色反应定量糖的浓度，从而指示皮层水解的程度。

方案

1. 显色试剂

1. 样品置于冰上时，开始配制显色试剂。将 0.320 g 的 p-二甲基氨基苯甲醛（DMAB；Ehrlich 试剂）溶于 1.9 ml 冰醋酸中。
   注意：该试剂对时间、温度和光敏感，不应提前配制。
2. 待 DMAB 完全溶解后，加入 100 µl 10 N HCl，并涡旋混匀。
3. 加入 5 ml 冰醋酸，并涡旋混匀。

2. 比色反应

1. 将每份冷却的大脑皮层样品各100 µl转移至新的1.5 ml微量离心管中。
2. 向每份样品中加入700 µl新鲜配制的显色液。
3. 立即将样品放入37 °C水浴中，准确孵育20分钟。
4. 将每份样品各200 µl转移至透明的96孔板中。
5. 使用酶标仪在585 nm波长下定量检测样品。样品初始呈黄色，阳性反应会转变为紫色。皮层组织越多，紫色越深。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.0 mL 螺口管	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf 移液器	Eppendorf
p200 Eppendorf 移液器	Eppendorf
p20 Eppendorf 移液器	Eppendorf
100–1250 µL 移液器吸头	VWR	89079-486
1–200 µL 移液器吸头	VWR	89079-458
N-乙酰-D-葡萄糖胺	Sigma	A3286-25G
乙酸酐	Alfa Aesar	L04295
碳酸氢钠	BDH	BDH0280-500G
四硼酸钾四水合物	Alfa Aesar	39435
氢氧化钠	BDH	BDH8019-500G
4-(二甲氨基)苯甲醛	Sigma	156477-100G
SpectraMax M3	Molecular Devices
冰乙酸	BDH	BDH3098-3.8LP
循环加热水浴锅	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072
培养管	VWR	89000-506	96 孔透明组织培养板
加热金属块
涡旋振荡器