细菌来源囊泡中重组蛋白的生产与回收

本文内容

摘要

本视频展示了从细菌囊泡中生产和分离带有囊泡成核肽（VNp）标签的重组蛋白的方法。通过诱导剂触发带有VNp标签的蛋白表达，驱动囊泡形成并实现蛋白包封，随后通过离心和超声处理，无需细胞裂解即可高效回收目标蛋白。

方案

1. 细菌细胞培养与蛋白诱导

为了从T7启动子诱导重组蛋白表达，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），使其终浓度达到20 µg/mL（84 µM）。为生产囊泡，重组蛋白表达的诱导必须发生在对数生长后期（即典型的光密度OD₆₀₀为0.8–1.0）。
注意：不同蛋白的诱导时间可能有所不同，某些蛋白在4小时达到最大产量，而另一些则需过夜（18小时）。迄今为止，过夜培养可获得最高的囊泡分泌量。

2. 重组囊泡的分离

在 4 °C 条件下，以 3,000 x g 离心 20 分钟，收集细胞沉淀。
为对含囊泡的培养基进行灭菌以长期保存，将澄清的培养基通过无菌且无去污剂的 0.45 µm 聚醚砜（PES）滤膜过滤。
注意：为检测含囊泡的滤液中是否排除了活细胞，可将滤液接种至溶菌肉汤（LB）琼脂平板，并在 37 °C 下过夜培养。
为将囊泡浓缩至较小体积，将无菌的含囊泡培养基通过无菌且无去污剂的 0.1 µm 混合纤维素酯（MCE）滤膜过滤。
使用细胞刮刀或塑料涂布棒，以 0.5–1 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔冲洗滤膜，小心将囊泡从膜上洗脱下来，转移至新的微量离心管中。
注意：纯化的囊泡可保存在无菌培养基或 PBS 中，于 4 °C 储存。已有报道显示，重组蛋白在这些囊泡中保存 6 个月后仍无酶活性损失。

3. 从分离囊泡中释放可溶性蛋白质

将含有蛋白质的囊泡分离至无菌培养基/缓冲液后，使用仪器适当的程序对囊泡脂质膜进行超声处理（例如，6次20秒开/关循环），然后在39,000 × g 条件下（4 °C）离心20分钟，以去除囊泡碎片。注意：可采用渗透压休克或去垢剂处理作为打开囊泡的替代方法，但必须考虑其对蛋白质功能和/或下游应用的影响。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	Melford	367-93-1
LB 培养基（Lysogeny Broth）/ LB 琼脂	实验室库存	NA	10 g/L 胰蛋白胨；10 g/L 氯化钠；5 g/L 酵母提取物（琼脂 1.5 g/L）
MF-Millipore 膜滤器（0.1 µm，MCE）	Merck	VCWP04700
Millipore Express PLUS 膜滤器（0.45 µm，PES）	Merck	HPWP04700
磷酸盐缓冲液（PBS）	实验室库存	NA