F质粒转移及大肠杆菌中的双重抗生素筛选

摘要

来源： Erdogan, F.,et al., 用于分析细菌接合中转移蛋白序列特异性的接合交配实验。J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了使用救援质粒将F质粒从供体菌转移至受体菌大肠杆菌（E. coli）细胞，并通过双重抗生素抗性筛选转接合子的操作流程。该过程包括混合细菌培养物、静置培养、破坏接合对，以及在选择性培养基上涂布，以确认质粒转移成功。

方案

1. 从XK1200供体菌到MC4100受体菌的接合交配实验

1. 制备 XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gene 菌株的过夜培养物 在20 mL无菌Lysogeny肉汤（LB）中加入20 μg/mL氯霉素（Cm）、50 μg/mL卡那霉素（Km）以及MC4100细胞，在5 mL LB中加入50 μg/mL链霉素（Sm），使用来自甘油保存菌种或琼脂平板上单菌落的细胞，通过无菌移液管或接种环接种。将培养物置于 37 °C，200 rpm 振荡培养。
2. 将各过夜培养物分别用含相同抗生素的2 mL无菌LB培养基做1:70稀释。向所有供体细胞中加入葡萄糖，使其终浓度为100 mM。将细胞培养至对数中期（OD₆₀₀ 37 °C、200 rpm 摇床培养至 OD600 为 0.5–0.7。
3. 离心（4,000 × g，4 °C，5 min）沉淀细胞，弃上清，用冷的无菌LB培养基洗涤一次以去除抗生素，将细胞重悬于2 mL冷的无菌LB培养基中。
4. 将每种培养物各取 100 μL，重复设两个样本，加入到 800 μL 无菌 LB 培养基中，于 37 °C 静置孵育 1 h，使其接合。
5. 涡旋振荡细胞30秒以破坏交配对，并将细胞置于冰上10分钟，以防止进一步交配。
6. 使用涡旋混匀的混合液和新鲜无菌的LB培养基，制备6个稀释度（10⁻¹至10⁻⁶）^-2 至 10^-7) 接合子。通过将每个稀释度的 10 μL 等分试样点样于含有 50 μg/mL Sm 和 20 μg/mL Cm 的琼脂平板的每一半，筛选 MC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm 接合子细胞，如 图1对两份重复混合物进行相同操作。保持操作区域无菌，并在火焰附近操作。将培养皿在37 °C下过夜培养。

结果

图1：用于评估目标基因在接合过程中的功能的交配实验。 供体细胞和受体细胞分别为E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm（转化了pK184-TraF质粒）和MC4100。所获得的转接合子（MC4100 pOX38-Tc Δtra...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养皿	Fisher Scientific	FB0875713
抗生素			终浓度
氯霉素（Cm）	Fisher Scientific	BP904-100	20 µg/mL
卡那霉素（Km）	BioBasic Inc.	DB0286	50 µg/mL
链霉素（Sm）	Fisher Scientific	BP910-50	50 µg/mL