利用光激活的黄素单核苷酸使细菌失活

摘要

来源：Cheng, C., 等. 利用核黄素-5′-磷酸可见光光解灭活病原体. J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种评估黄素单核苷酸（FMN）对致病菌光毒性作用的方法。将细菌培养物暴露于逐渐增加浓度的FMN中，并用可见光照射以产生活性氧（ROS），从而损伤细菌的细胞组分。随后通过定量存活细菌来评估其活力随剂量增加而降低的情况。

方案

1. 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） FMN 光解后的存活率（图 1）
   1. 传递一个菌落 S. aureus （BCRC 10451）接种于装有10 mL LB培养基的15 mL带螺帽试管中，在37°C摇床中培养16 h。
   2. 将0.5 mL培养物转移至1.5 mL离心管中。向离心管中加入灭菌水，将培养物稀释至在600 nm处的光密度值为0.5（OD₆₀₀) （约 6 × 10⁷ 菌落形成单位 [CFU]/mL
   3. 将0.5 mL培养物转移至1.5 mL离心管中，于14,000 x g 10 分钟后，倾去上清液以获得细胞沉淀。
   4. 向按步骤获得的细胞沉淀中加入1 mL核黄素-5'-磷酸盐（或黄素单核苷酸；FMN）缓冲溶液（含30、60和120 μM FMN的磷酸钾缓冲液[PB]） 1.3，涡旋混匀。对于照射对照组，仅加入1 mL PB。
   5. 将含有30 μM FMN的活菌细胞溶液和仅含PB的溶液各1 mL分别转移至玻璃试管中，并用10 W/m²的紫光照射² 30 分钟
   6. 将含有30、60和120 μM FMN以及仅含PB的活性细菌细胞溶液各1 mL分别转移至玻璃试管中，并用20 W/m²的蓝光照射² 120分钟。另取一支玻璃管，加入1 mL含有120 μM FMN的活菌细胞溶液，并用20 W/m²的蓝光照射。² 60 分钟。
   7. 按照步骤中所述设置试管 1.5 和 1.6 用厚铝箔包裹。这些试管作为暗对照。
   8. 在30-120分钟的照射期间，将照射室（以及暗处理对照组）置于9 ± 1 °C的冷室中。
      注意： 发光二极管（LED）灯释放的热量不可忽略，因为置于反应杯内的LED芯片可能在辐照实验过程中加热光反应体系。因此，实验在温度维持为9 ± 1 °C的低温室中进行。
   9. 辐照后，从每种反应液中转移 0.2 mL 至 Luria 琼脂（LA）平板。用 L 形玻璃涂布棒将细菌均匀涂布于平板表面，37 °C 过夜培养。
   10. 计算活菌平板计数及灭活率 S. aureus 过夜培养后。

注意： S. aureus 的失活率以百分比减少值计算，等于 [1 − I / D] ×100%，其中 I 和 D 分别表示照射样品和暗对照中的菌落形成单位（CFU）数量。百分比减少值定义为失活率的负值。

结果

图1：FMN光解对 S. aureus 活力 百分比减少定义为金黄色葡萄球菌经处理后失活率的负值A) 蓝光照射（20 W/m²）下的FMN² ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蓝色、绿色和红色 LED 灯	Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan		DC 12 V 5050
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
红外测温仪	Raytek Co. Santa Cruz, CA	MT4
LB 肉汤培养基	Difco Co., NJ
L-甲硫氨酸	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
氮蓝四唑（NBT）	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
电源供应器	China tech Co., New Taipei City, Taiwan	YP30-3-2
核黄素 5′-磷酸	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R7774
RNase	New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
太阳能功率计	Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	生物资源保存与研究中心（BCRC），中国台湾新竹	10451
紫外-可见光光学光谱仪	Ocean Optics, Dunedin, FL	USB4000
紫外-可见分光光度计	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokyo, Japan	U-2900
紫色 LED	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China