通过活性氧产生量化光诱导的细菌灭活

摘要

资料来源： Cheng， C. 等人。通过核黄素-5'-磷酸盐的可见光光解灭活病原体。J. Vis. Exp. （2022）。

在本视频中，用紫光照射含有 L-蛋氨酸、硝基蓝四唑 （NBT） 和黄素单核苷酸 （FMN） 的缓冲反应混合物，以诱导活性氧 （ROS） 的产生。这导致细菌失活并形成光谱可检测的甲臜。

方案

1. 金黄色葡萄球菌中活性氧（O₂•⁻）的检测

1. 制备 金黄色葡萄球 菌样品。
2. 用灭菌水将样品的细菌密度稀释至600nm处的光密度为0.5（OD（光密度）₆₀₀，~6 x 10⁶ CFU（菌落形成单位）/mL）。将 0.5 mL 培养物转移到 1.5 mL 离心管中。以 14,000 x g 离心 10 分钟，然后倒出上清液以获得细胞沉淀。
3. 将 0.1093 g L-蛋氨酸、0.1 g NBT（硝基蓝四唑氯化物）和 25 mL FMN（黄素单核苷酸）（400、240 或 120 μM）加入 75 mL PB（磷酸盐缓冲液）中。对于每施加1mL的反应物，FMN，蛋氨酸和NBT的最终浓度分别为100（60或30）×^10-6 M，7.3×^10-3 M和1.2 × ^10-3 M。
4. 将 1 mL 的每种反应物溶液（即具有不同的 FMN 浓度）添加到获得的细胞沉淀中。用紫光以 10 W/m² 照射溶液 10 分钟。
5. 将混合物以 14,000 x g 离心 10 分钟，然后倒出上清液。将沉淀重悬于 1 mL 二甲基亚砜 （DMSO） 中以提取还原的 NBT。从 560 nm 处的吸光度检测产生的 O₂•⁻ 物质。

材料