通过活性氧生成对光诱导细菌失活的定量分析

摘要

来源：Cheng, C., 等．利用可见光光解核黄素-5′-磷酸盐使病原体失活．J. Vis. Exp. (2022)。

在本视频中，含有 L-甲硫氨酸、氮蓝四唑（NBT）和黄素单核苷酸（FMN）的缓冲反应混合物经紫光照射，以诱导产生活性氧（ROS）。这会导致细菌失活，并形成可通过分光光度法检测的甲臜。

方案

1. 检测活性氧（O₂•⁻） 金黄色葡萄球菌

1. 准备Staphylococcus aureus样品。
2. 用无菌水将样品的细菌密度稀释至600 nm处的光密度（OD（光密度）₆₀₀）为0.5（约6 × 10⁶ CFU（菌落形成单位）/mL）。取0.5 mL培养物转移至1.5 mL离心管中，在14,000 × g下离心10分钟，弃去上清液，获得细胞沉淀。
3. 将0.1093 g L-甲硫氨酸、0.1 g NBT（氯化硝基蓝四氮唑）、以及25 mL FMN（黄素单核苷酸）（400、240 或 120 µM）加入75 mL磷酸缓冲液（PB）中。每使用1 mL反应液，FMN、甲硫氨酸和NBT的终浓度分别为100（60 或 30）× 10^-6 M、7.3 × 10^-3 M 和 1.2 × 10^-3 M。
4. 向所得细胞沉淀中分别加入1 mL各反应液（即含不同FMN浓度的溶液），并在10 W/m²的紫光照射下处理10分钟。
5. 将混合物在14,000 × g下离心10分钟，弃去上清液。用1 mL二甲基亚砜（DMSO）重悬沉淀，以提取还原的NBT。通过在560 nm处测定吸光度检测生成的超氧阴离子（O₂•⁻）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
红外温度计	Raytek Co. Santa Cruz, CA	MT4
LB肉汤	Difco Co., NJ
L-甲硫氨酸	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT（硝基蓝四氮唑氯化物）	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
电源	China tech Co., New Taipei City, 中国台湾	YP30-3-2
核黄素5′-磷酸	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R7774
太阳能功率计	Tenmars Electronics Co., Taipei, 中国台湾	TM-207
Staphylococcus aureus 亚种 aureus	生物资源保存与研究中心（BCRC），新竹，中国台湾	10451
紫外-可见光谱仪	Ocean Optics, Dunedin, FL	USB4000
紫外-可见分光光度计	Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan	U-2900
紫光LED	龙辉电子有限公司，东莞，中国