测定载抗生素聚合物条的抗菌功效

摘要

来源： Sekar, A., et. al.，一种测定载药材料纵向抗菌活性的新方法。J. Vis. Exp. （2023）

本视频展示了一种基于发光的检测方法，通过定量由ATP驱动的发光信号来评估载有抗生素的聚合物条带的抗菌效果，该发光信号在暴露于抗生素的细菌培养物中会减弱。

方案

时间依赖性抗菌活性研究实验设置

1. 在1 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中过夜培养细菌。
2. 将过夜培养的细菌悬液稀释至10⁵ 在无菌MHB（Mueller-Hinton肉汤）中配制至CFU/mL，并在实验开始前通过发光单位验证活菌数量。
3. 将未使用的超高分子量聚乙烯（UHMWPE）和载药UHMWPE条（3 mm × 5 mm × 10 mm）置于3 mL注射器内。
4. 吸取含有10的MHB⁵ CFU/mL 通过连接的针头注入注射器，直至1.5 mL刻度处，相当于1.35 mL的MHB （图1：步骤1）.
5. 将注射器装置置于摇床培养箱中（100 rpm，37 °C），在指定时间点取出：6 h、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天 （图1：步骤2）.
6. 在每个指定时间点，取出注射器装置，对100 µL细菌悬液进行实时微生物活力检测 （图1：步骤3-4）.
   1. 使用白色不透明底的96孔板进行基于发光的检测。
   2. 将100 µL稀释的细菌悬液与100 µL检测试剂混合。
   3. 将覆盖有铝箔的板盖盖在已准备好的96孔板上，于100 rpm振荡条件下孵育5分钟。
   4. 使用 Gen5 3.11 软件中的以下设置，立即用酶标仪测定发光值。
      1. 点击 新 建立一个方案 任务管理器 窗
      2. 选择 Costar 96 孔白色不透明板 在下拉菜单中 板型.
      3. 点击 读取 在……之下 选择步骤 > 操作 菜单
      4. 点击 发光 在……之内 阅读方法 窗口。保持 终点/动力学与发光纤维 分别在读取类型和光学类型下选择的选项。单击 好的.
      5. 保持 <默认> 设置中的 读取步骤 窗口（增益 = 135；积分时间 = 1 秒；读取高度 = 4.5 mm）。点击 好的.
      6. 运行准备就绪的板布局窗口已出现。在加载板窗口中勾选“使用盖板”选项，然后单击 好的.
      7. 将96孔板放入仪器中读取发光值。
7. 测定6小时、第1天、第2天、第3天和第7天时间点的可存活细菌数量。根据相应的标准曲线，由发光单位计算每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。
8. 通过在TSA（胰蛋白酶大豆琼脂）平板上进行涂布平板法，并于35 °C过夜培养，验证发光值低于检测限的样品中是否存在可存活细菌。次日检查菌落生长情况。
9. 将剩余的细菌悬液在 10,000 × g 孵育10分钟，轻柔吸除废液。对于因药物抗菌活性而无法肉眼观察到沉淀的试管，保留100 µL液体，以确保未见的沉淀不受扰动 （图1：步骤5）.
10. 将菌体沉淀重悬于新鲜的MHB中，并通过连接的针头将细菌悬液重新吸入相同的注射器装置中 （图 1：步骤 6）.

结果

图1：实验装置的示意图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ATCC 12600	美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚州，美国
BacTiter-Glo 微生物细胞活力检测试剂盒	Promega 公司，美国	G8231
BD Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤（大豆-酪蛋白消化物培养基）	贝克顿-迪金森公司，美国	BD 211825	购自 Fisher Scientific，美国
BD Luer-Lok 无菌一次性 3 mL 注射器	BD，美国	309657
BD 针头 5/8 英寸，一次性，无菌，25 G	BD，美国	305122
BD BBL 脱水培养基：Mueller Hinton II 肉汤（阳离子调节型）	贝克顿-迪金森公司，美国	B12322	购自 Fisher Scientific，美国
BD Difco 脱水培养基：胰蛋白胨大豆琼脂（大豆-酪蛋白消化物琼脂）	贝克顿-迪金森公司，美国	DF0369-17-6	购自 Fisher Scientific，美国
硫酸庆大霉素	福建福康药业有限公司，福州，中国
LSE 台式振荡培养箱	Corning，纽约州，美国
酶标仪（Synergy H1）	Biotek，佛蒙特州，美国
摇床 Innova 2100	New Brunswick Scientific，新泽西州，美国
UHMWPE	GUR1020，Celanese，德克萨斯州，美国
盐酸万古霉素	Fagron，荷兰	804148